HCV VectorによるHCV感染過程の制御分子の同定

使用HCV载体鉴定调节HCV感染过程的分子

• 批准号: 14657129
• 负责人: 榎本 信幸
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Tokyo Medical and Dental University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14657129/
• 关键词: C型肝炎ウイルス; レプリコン・システム; 分子標的治療; ウイルスベクター; 抗ウイルス療法; Small interfering RNA; 感染レセプター; インターフェロン; レプリコン; 慢性肝炎; 肝癌細胞

本研究は、新たなHCV増殖系であるHCV replicon系を応用して、細胞内でのHCV-RNA遺伝子複製過程を制御する分子群を同定することを目的として行われ、今年度次の成果を得た。1.HC-J4株から独自に構築したレプリコンにおいて、NS5A領域の特定のアミノ酸変異を有するクローンが高レベルのゲノム増殖を生じることを明かにした(J Viral Hepatitis 2004 in press)。2.キメラ・リポーター発現レプリコンを用いたウイルス増殖定量システムを構築し、インターフェロン、リバビリン等の薬剤を用いたウイルス増殖抑制効果の定量的解析の結果を報告した(J Infect Dis2004 in press)。3.宿主遺伝子を特異的に破壊するsmall interfering RNA(siRNA)の効果を解析するためHCVゲノムを標的とするsiRNAを構築し、レプリコン発現細胞に導入したところ、強い遺伝子破壊効果(最大96%)が認められた。さらに、細胞内でヘアピン型siRNAを発現するDNAプラスミドベクターを構築し抑制効果を確認した。4.インターフェロン誘導遺伝子の発現を制御するinterferon regulatory factor(IRF)1及びIRF-3を遺伝子導入することにより、レプリコン増殖が著明に抑制された。またIRF-3をsiRNAにより抑制したところHCV増殖が上昇し、細胞内においてIRFの機能がウイルス持続感染増殖に密接に関与することを見いだした(論文投稿中)。本研究により同定される分子群はいずれもHCV研究あるいは治療開発の新しい分野への展開が期待できるものであり、今後さらにウイルス増殖に関与する宿主蛋白の同定、抗ウイルス療法の新たな標的分子の探索を遂行して行く。

This is the first time that we have achieved this goal by identifying the molecular population that controls HCV replication in a novel HCV clone and by using HCV replicon systems in cells. 1. HC-J4 strain was constructed independently of NS5A and NS5A in order to establish a unique and diverse system for NS5A (J Viral Hepatitis 2004 in press). 2. Report on the results of quantitative analysis of growth inhibition effects in the construction of quantitative analysis methods for growth inhibition effects (J Infect Dis2004 in press). 3. Small interfering RNA(siRNA) gene expression in host gene specific RNA expression vector was analyzed by PCR and siRNA expression vector was constructed by PCR and introduced into host gene expression cells. DNA sequence analysis for the development of intracellular siRNAs was performed to confirm the inhibitory effect. 4. Interferon regulatory factor(IRF)1 and IRF-3 are involved in the regulation of the expression of the inducible gene. IRF-3 siRNA inhibits HCV proliferation, and the function of IRF in cells is closely related to HCV infection and proliferation (paper submission). This study is aimed at identifying the molecular population involved in HCV research, exploring the development of novel therapeutic approaches, identifying host proteins associated with HCV propagation in the future, and exploring new target molecules for anti-HCV therapy.

项目成果

Sakamoto N, Yokota T, et al.: "Inhibition of intracellular hepatitis C virus replication by synthetic and vector-derived siRNAs"EMBO Roports. 4. 602-608 (2003)

Sakamoto N、Yokota T 等人：“通过合成和载体衍生的 siRNA 抑制细胞内丙型肝炎病毒复制”EMBO Roports。

Sakamoto N, et al.: "Synergistic inhibition of intracellular hepatitis C virus replication by combination of ribavirin and interferon-alpha"J Infect Dis. in press. (2004)

Sakamoto N 等人：“利巴韦林和干扰素-α 组合对细胞内丙型肝炎病毒复制的协同抑制”J Infect Dis。

Maekawa S, Sakamoto N, et al.: "Introduction of NS5A Mutations Enables Subgenomic HCV-Replicon Derived from Chimpanzee-Infectious HC-J4 Isolate to Replicate Efficiently in Huh-7"J Viral Hepatitis. (in press). (2004)

Maekawa S、Sakamoto N 等人：“NS5A 突变的引入使得源自黑猩猩感染性 HC-J4 分离株的亚基因组 HCV 复制子能够在 Huh-7 病毒性肝炎中高效复制”。

Sakamoto N. et al.: "Specific inhibition of hepatitis C virus replication by cyclosporin A"Biochem Biophys Res Com. 313. 42-47 (2004)

Sakamoto N. 等人：“环孢菌素 A 对丙型肝炎病毒复制的特异性抑制”Biochem Biophys Res Com。

Miyasaka Y, Sakamoto N, et al.: "Hepatitis C virus NS5A protein inhibits TNF-alpha mediated apoptosis in HUH7 Cells"J Infect Dis. 188. 1537-1544 (2003)

Miyasaka Y、Sakamoto N 等人：“丙型肝炎病毒 NS5A 蛋白抑制 HUH7 细胞中 TNF-α 介导的细胞凋亡”J Infect Dis。