染色体改変に基づく新規ヒト人工染色体ベクターの構築
基于染色体修饰的新型人类人工染色体载体的构建
基本信息
- 批准号:14657609
- 负责人:
- 金额:$ 1.98万
- 依托单位:
- 依托单位国家:日本
- 项目类别:Grant-in-Aid for Exploratory Research
- 财政年份:2002
- 资助国家:日本
- 起止时间:2002 至 无数据
- 项目状态:已结题
- 来源:
- 关键词:
项目摘要
ヒト人工染色体(Human Artificial Chromosome ; HAC)ベクター系は,染色体それ自体をベクターとして用いる。このため(1)宿主染色体に挿入されず独立して維持される(宿主遺伝子を破壊しない)、(2)一定のコピー数で長期間安定に保持される(過剰発現、発現消失の懸念がない)、(3)導入可能なDNAの長さに制限がない(正常な発現制御を保証するDNAエレメントを含む遺伝子や複数遺伝子を同時に導入可能)、という特徴が期待されるが,実現には至っていない。そこで本研究は,HAC基本ベクターの構築を目的とした。その手順として,(1)ヒト21番染色体から染色体改変技術により不要な遺伝子を除去したHACを作製する,(2)Cre/loxPシステムにより外来DNAを導入する手法を確立する,(3)導入遺伝子の発現を確認する,ことを計画した。ヒト染色体の改変は相同組換えを高頻度に起こすニワトリBリンパ細胞株DT40において行う。本年度は出発資材となるヒト21番染色体を保持するDT40雑種細胞の作製を行った。はじめにヒト染色体を1本保持するマウスA9細胞ライブラリーをヒト21番染色体上のSTSマーカーを用いたPCRによりスクリーニングし,21番染色体を保持するクローンを同定した。次に21番染色体を微小核細胞融合法によってDT40細胞に移入することを試みた。通常の方法ではG418耐性クローンが得られなかったため,移入法の条件検討を重ねた。その結果,浮遊細胞であるDT40をポリ-Lリジンでコートした培養ディッシュ上に付着させて細胞融合することで,G418耐性クローンが得られた。ヒト21番染色体上のSTSマーカーを用いたPCRとFISH解析によって,DT40雑種細胞中にヒト21番染色体が存在することを確認した。染色体改変によりHACベクターを構築するための出発資材が整備できたといえる。
Human Artificial Chromosome (HAC) is an artificial chromosome. (1) Host chromosome insertion is independent of maintenance.(2) Long-term stability of a certain number of host genes (suspense of occurrence and disappearance),(3) Restriction on the length of DNA that may be introduced (normal occurrence control ensures that DNA sequences may be introduced simultaneously with multiple genes), and (4) Expectation of characteristics (suspense of occurrence and disappearance). This study aims at HAC's basic structure. We plan to (1) create a HAC that removes unwanted DNA from chromosome 21 through chromosome modification technology,(2) establish a method for introducing foreign DNA into Cre/loxP systems, and (3) confirm the discovery of introduced DNA. The chromosome changes in the same group occur frequently in the cell line DT40. This year, the production of DT40 cells with 21 chromosomes was carried out. The chromosome 1 gene is maintained at the same time as the chromosome 21 gene by PCR. The second chromosome was transferred into DT40 cells by microcell fusion. Usually the method is G418, and the condition of the method is discussed again. As a result, floating cells were cultured in vitro, and G418 cells were cultured in vitro. PCR and FISH analysis confirmed the presence of chromosome 21 in DT40 cells. Chromosome modification: HAC structure and development materials preparation
项目成果
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