質量分析法によるリガンド-レセプター相互作用の精密解析

使用质谱法精确分析配体-受体相互作用

基本信息

批准号：
15651096
负责人：
入江一浩
金额：
$ 2.37万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

ソフトなイオン化を特徴とするエレクトロスプレー質量分析計(ESI-MS)は、タンパク質と金属イオンあるいは低分子リガンドとの非共有結合による相互作用を解析できる装置として期待されている。最近、発がんプロモーターであるホルボールエステルが、プロテインキナーゼCδ(PKCδ)のC1ドメインの亜鉛フィンガー様配列に結合することによって、PKC C1ドメインから亜鉛が放出され、その亜鉛が各種情報伝達に関与しているという興味深い仮説が提唱された。本研究は、PKC C1ドメインとホルボールエステル[phorbol 12,13-dibutyrate (PDBu)および12-O-tetradecanoylphorbol 13 acetate (TPA)]との結合をESI-MSによって解析し、亜鉛の放出を精密に検証することを目的とした。PKCδおよびPKCγのC1Bドメインの亜鉛フィンガー様配列を固相法により合成し、亜鉛でフォールディングした後、過剰の亜鉛を透析により取り除き凍結乾燥したものを実験に用いた。本ペプチドは、水に再溶解することによって、透析前のサンプルと同等の高いPDBu結合能を示した。次に、本PKC C1ペプチドをPDBuあるいはTPA、およびホスファチジルセリンとともにインキュベーションし、亜鉛特異的なキレート剤による蛍光強度を測定することによって、放出された亜鉛を定量した。その結果、ポジティブコントロールである過酸化水素の添加では、顕著な蛍光強度の増加が認められたが、ホルボールエステル類(PDBuおよびTPA)による変化は全く検出されなかった。さらに、ESI-MSを用いた解析を行なったところ、PDBuとPKC C1ペプチドとの結合体のピークが観測された。しかしながら、PDBu添加によるPKC C1ペプチドからの亜鉛原子の放出は認められなかった。

电喷雾质谱仪（ESI-MS）以软电离为特征，预计将是能够分析蛋白质与金属离子或小分子配体之间非共价相互作用的装置。最近，人们提出了一个有趣的假设，即致癌物促进剂Phorbol酯与蛋白激酶Cδ（PKCδ）的C1结构域的锌指序列结合，从而从PKC C1结构域释放锌，并且锌参与了各种信号。这项研究旨在通过ESI-MS通过分析PKC C1结构域与Phorbol Ester [Phorbol 12,13-二丁酸酯（PDBU）和12-O-tetradecanoylphorbol 13乙酸盐（TPA）]的结合来准确验证锌的释放。 PKCδ和PKCγ的C1b结构域的锌指序列通过固相方法合成，用锌折叠，然后通过透析和冷冻干燥去除过量的锌。通过在水中重新溶解，肽在透析前表现出可比的高PDBU结合能力作为样品。然后，将PKC C1肽与PDBU或TPA和磷脂酰丝氨酸一起孵育，以通过用锌特异性螯合剂测量荧光强度来量化释放的锌。结果，添加过氧化氢，这是一个阳性对照，显示出荧光强度的显着增加，但由于凤凰酯（PDBU和TPA）未引起变化。此外，当使用ESI-MS进行分析时，观察到PDBU和PKC C1肽之间的共轭峰。但是，通过添加PDBU观察到从PKC C1肽中释放锌原子。