インドール環4位への窒素原子導入酵素の触媒機構の解析と応用

吲哚环4位引入氮原子的酶催化机理分析及应用

基本信息

批准号：
20658029
负责人：
入江一浩
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-20658029/
关键词：
indolactam-V teleocidin 生合成 NRPS P450 発がんプロモーター Streptomyces

项目摘要

本研究代表者らは,発がんプロモーター・テレオシジンの基本骨格であるインドラクタム-V(IL-V)を大量に産生する特異な放線菌(Streptomyces blastmyceticus NA34-17株)を用いて,IL-Vの4位セコ体であるN-methyl-L-valyl-L-tryptophanolが,IL-Vの生合成前駆体であることを明らかにした.またIL-V前駆体は,非リボソーム型ペプチド合成酵素(NRPS)によって合成されることが予想されている.昨年,本菌株におけるテレオシジン生合成遺伝子群は,NRPSをコードするtcnA,IL-Vへのモノテルペン側鎖導入酵素をコードするtcnD,機能未同定のMbtHをコードするtcnB,さらにcytochrome P450 oxidaseをコードするtcnCからなることを明らかにした.本年度は,TcnB及びTcnCをHis-tag融合タンパク質として大腸菌で大量発現させた.TcnB及びTcnCは,それぞれ8.6及び44.7kDの可溶性タンパク質として調製できた.TenCは,ポルフィリン環に起因する極大吸収が410nm付近に認められ,P450であることが示唆された.そこでTenC及びTenBを用いて,ホウレンソウ由来ferredoxinやferredoxin reductaseなどのP450還元再生系タンパク存在下でN-methyl-L-valyl-L-tryptophanolのIL-Vへの閉環を試みたが,IL-Vの生成を確認できなかった.TcnCがホウレンソウ由来の還元再生系では活性化していない可能性があり,TcnC特異的な還元再生系が必要なのかも知れない.今後in vivoでの閉環反応の検出も視野に入れて,放線菌(Streptomyces lividans TK-24)での発現を試みる必要がある.

The researchers used a unique actinomyces (Streptomyces blastmyceticus strain NA34-17), which produces in large quantities of indolactam-V (IL-V), the basic backbone of the carcinogenic promoter, teleocidin, to reveal that N-methyl-L-valyl-L-tryptophanol, the secoform of IL-V, is a biosynthetic precursor of IL-V. IL-V前体有望通过非核糖体肽合酶（NRP）合成。去年，这种菌株中的链球菌素生物合成基因包括编码NRP的TCNA，TCND编码单键烯侧链链酶引入酶，TCNB编码未指定的MBTH，以及CytoChrome P450和CytoChrome P450，并且它表明它由TCNC编码氧化酶组成。在今年，TCNB和TCNC在大肠杆菌中大量表示为HIS-TAG融合蛋白。 TCNB和TCNC分别为8.6和44.7 kD的可溶性蛋白制备。 TenC由于410 nm左右的卟啉环引起的最大吸收，表明它是P450。因此，TenC和TENB用于使用菠菜来源的铁氧还蛋白和铁氧还蛋白。我们试图在存在P450还原蛋白（如还原酶）的情况下将N-甲基-L-丙基-l- tryptophanol关闭至IL-V，但我们无法确认IL-V的形成。在菠菜衍生的再生系统中，TCNC可能未激活，并且可能需要使用TCNC特异性再生系统。将来，有必要尝试在放线菌（链霉菌Lividans TK-24）中表达它，以检测体内环闭合反应。