インスリン受容体キナ-ゼの細胞内基質蛋白・pp185の純化とcDNAクロ-ニング

胰岛素受体激酶细胞内基质蛋白pp185的纯化及cDNA克隆

• 批准号: 63480266
• 负责人: 春日 雅人
• 金额: $ 4.74万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (B)
• 财政年份: 1988
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1988 至 1989
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-63480266/
• 关键词: 抗燐酸化チロシン抗体; モノクロナル抗体; インスリン受容体キナーゼ; チロシンキナーゼの基質; チロシン燐酸化蛋白

インスリン受容体キナ-ゼの細胞内基質蛋白であるpp185の純化を試みるにあたって、まずモノクロナル抗体を作製することとした。ラット肝癌由来細胞株であるH-35細胞を2000dish(φ10cm)培養し、インスリン刺激後、細胞を可溶化して、抗燐酸チロシン抗体アフィニティカラムで純化した。この分画をSDS-PAGEにて分離後、分離した蛋白をニトロセルロ-スシ-トに転移し、分子量185,000の部位のみ切り出し、細く砕いた後、マウスに免役した。このような試みを合計3回行ったが、残念ながらpp185に対するモノクロナル抗体は得られなかった。その原因としては、(1)ラットの細胞を用いたため、ラットpp185はマウスに対して抗原性が乏しかった。(2)免役したpp185の蛋白量が乏しかった。などが考えられた。これらの点を克服するために、(1)ヒト肝癌由来細胞株であるHcpG2細胞を用いる。(2)より容量の大きい抗燐酸化チロリン抗体アフィニティカラムを用いる。という二点を最大の改良点として、再度pp185に対するモノクロナル抗体の作製を試みている。今回の改良法により、pp185に対するモノクロナル抗体が得られるかどうかは未だ不明であり、現在の所はっきりした成績はない。もしモロクロナル抗体がうまく得られれば、これらのモノクロナル抗体を用いてイムノアフィニティカラムを作製する予定である。pp185の純化にはこれらのイムノアフィニティカラムが強力な武器となることは十分創造されるところであり、純化のためにはモノクロナル抗体が必要不可欠と考えられる。

イ ン ス リ ン by let body キ ナ - ゼ の matrix proteins in cells で あ る pp185 の purification を try み る に あ た っ て, ま ず モ ノ ク ロ ナ ル antibody を cropping す る こ と と し た. ラ ッ ト origin of liver cancer cell lines で あ る を 2000 H - 35 cell dish 10 cm (phi) し, イ ン ス リ ン stimulation, cell を solubilization し て, resisting 燐 acid チ ロ シ ン antibody ア フ ィ ニ テ ィ カ ラ ム で purification し た. こ の points draw を sds-page に て after separation, separation し た protein を ニ ト ロ セ ル ロ - ス シ - ト に planning move し and molecular weight of 185000 の の み り し, fine cutting く 砕 い た, マ ウ ス に immune し た. こ の よ う な try み を combined 3 return っ た が, residual な が ら pp185 に す seaborne る モ ノ ク ロ ナ は ル antibodies to ら れ な か っ た. そ の reason と し て は, (1) ラ ッ ト の cells を using い た た め, ラ ッ ト pp185 は マ ウ ス に し seaborne て antigenicity が spent し か っ た. (2) Exemption from aging たpp185 <s:1> protein content が deficiency <s:1> った った. Youdaoplaceholder0 な が take えられた. <s:1> れら れら を points を to overcome するために, (1)ヒト liver cancer origin cell line であるHcpG2 cells を use る る. (2) The capacity of よ <s:1> is large, and the anti-phosphoenation チロリ <s:1> antibody アフィニティカラムを is produced using よ る. と い う を の biggest improvement point 2 o 'clock と し て, again pp185 に す seaborne る モ ノ ク ロ ナ ル を try the antibody の cropping み て い る. Today back to の improved method に よ り, pp185 に す seaborne る モ ノ ク ロ ナ が ル antibodies to ら れ る か ど う か は not unknown だ で あ り, now の は っ き り し た grades は な い. も し モ ロ ク ロ ナ ル antibody が う ま く have ら れ れ ば, こ れ ら の モ ノ ク ロ ナ を ル antibody with い て イ ム ノ ア フ ィ ニ テ ィ カ ラ ム を cropping す る designated で あ る. Pp185 の purification に は こ れ ら の イ ム ノ ア フ ィ ニ テ ィ カ ラ ム が powerful weapons な と な る こ と は is creating さ れ る と こ ろ で あ り, purification の た め に は モ ノ ク ロ ナ が necessary not owe と ル antibody test え ら れ る.

项目成果

Takayama-Hasumi,S.,Tobe,K.,Momomura,K.,Koshio,O.,Tashiro-Hashimoto,Y.,Akanuma,Y.,Hirata,Y.,Takaku,F.,and Kasuga,M.: "Autoantibodies to the insulin receptor(B-10)can stimulate tyrosine phosphorylation of the β-subunit of the insulin receptor and a 185,000

Takayama-Hasumi, S.、Tobe, K.、Momomura, K.、Koshio, O.、Tashiro-Hashimoto, Y.、Akanuma, Y.、Hirata, Y.、Takaku, F. 和 Kasuga, M.： “胰岛素受体自身抗体 (B-10) 可以刺激胰岛素受体 β 亚基的酪氨酸磷酸化，并产生 185,000

Takayama-Hasumi,S.;Tobe,K.;Momomura,K.;Koshio,O.;Tashiro-Hashimoto,Y.;Akanuma,Y.;Hirata,Y.;Takaku,F.;Kasuga,M.: J.Clin.Endocrinal.Metab.(1989)

高山莲见，S.；户部，K.；桃村，K.；小潮，O.；田代桥本，Y.；赤沼，Y.；平田，Y.；高久，F.；春日，M.：J

Tashiro-Hashimoto,Y.,Tobe,K.,Koshio,O.,Izumi,T.,Takaku,F.,Akanuma,Y.,and Kasuga.M.: "Tyrosine-phosphorylation of pp185 by insulin receptor kinase in a cell-free system." (J.Biol.Chem.). 264. 6879-6885 (1989)

Tashiro-Hashimoto,Y.,Tobe,K.,Koshio,O.,Izumi,T.,Takaku,F.,Akanuma,Y.,and Kasuga.M.：“胰岛素受体激酶对 pp185 的酪氨酸磷酸化

Tashiro-Hashimoto,Y.;Tobe,K.;Koshio,O.;Izumi,T.;Takaku,F.;Akanuma,Y.;Kasuga,M.: J.Biol.Chem.(1989)

田代桥本，Y.；户部，K.；小潮，O.；泉，T.；高库，F.；赤沼，Y.；春日，M.：J.Biol.Chem.(1989)

Tobe,K.,Koshio,O.,Tashiro-Hashimoto,Y.,Takaku,F.,Akanuma,Y.,and Kasuga.M.: "Immunological detection of phosphotyrosine-containing proteins in rat livers following insulin injection." (Diabetes). (1989)

Tobe, K.、Koshio, O.、Tashiro-Hashimoto, Y.、Takaku, F.、Akanuma, Y. 和 Kasuga.M.：“胰岛素注射后大鼠肝脏中含磷酸酪氨酸的蛋白质的免疫学检测。”