燐酸化チロシンに対する特異的モノクロ-ナル抗体の開発と量変化ー腫瘍の診断ならびに情報伝達機構の解明のためにー

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本年度は、燐酸化チロシンに対する抗体を作製する時の抗原として、チロシン燐酸化酵素をコ-ドする癌遺伝子vーablを大腸菌に発現させ大腸菌中のさまざまな蛋白をチロシン燐酸化させたものを抗原として用いた。BALB/Cマウスのhind padに上記の大腸菌蛋白を200〜400μg,3日〜4日おきに4回注射免疫し、最終免疫4日後にリンパ節より得たリンパ球1×10^8個とSP2/0ミエロ-マ細胞3×10^7個をPEG法にて細胞融合を行った。スクリ-ニングには自己燐酸化インスリン受容体の免疫沈降を用いた。その結、燐酸化チロシンに対する特異的モノクロナル抗体1D7を得ることができた。この抗体についてその特異性を検討すると、イムノブロッティング法において、インスリン刺激後の細胞において95Kのインスリン受容体βサブユニット,64K,61K,54K,41Kの蛋白を認識し、これらは燐酸化チロシンの存在により消失したが、燐酸化セリン、燐酸化スレオニンの存在では全く影響をうけなかった。以上より、このモノクロナ-ル抗体が、燐酸化チロシンを特異的に認識しているのは明らかである。また、インスリン刺激後に認識されるチロシン燐酸化蛋白についても、昨年度迄に我々が作製したモノクロナル抗体あるいはすでに米国において市販されている抗燐酸化チロシンモノクロナル抗体PY20とかなり異ることが明らかとなった。すなわち,185Kのチロシン燐酸化蛋白は、我々が作製したモノクロナル抗体でよく認識されるが、今回の1D7やPY20ではあまりよく認識されない。一方、I型PIキナ-ゼ活性は、PY20によりよく免疫沈降されるが、1D7ではその10%程度しか免疫沈降されないことが明らかとなった。