燐酸化チロシンに対する特異的モノクロ-ナル抗体の開発と量変化ー腫瘍の診断ならびに情報伝達機構の解明のためにー

磷酸化酪氨酸特异性单克隆抗体的开发及其量的变化 - 用于肿瘤的诊断和信息传递机制的阐明 -

• 批准号: 63870030
• 负责人: 春日 雅人
• 金额: $ 13.25万
• 依托单位: Kobe University (1990)The University of Tokyo (1988-1989)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Developmental Scientific Research (B)
• 财政年份: 1988
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1988 至 1990
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-63870030/
• 关键词: Vーabl; I型Pエキナ-ゼ活性; phosphotyramine; 燐酸化チロシン; モノクロナル抗体

本年度は、燐酸化チロシンに対する抗体を作製する時の抗原として、チロシン燐酸化酵素をコ-ドする癌遺伝子vーablを大腸菌に発現させ大腸菌中のさまざまな蛋白をチロシン燐酸化させたものを抗原として用いた。BALB/Cマウスのhind padに上記の大腸菌蛋白を200〜400μg,3日〜4日おきに4回注射免疫し、最終免疫4日後にリンパ節より得たリンパ球1×10^8個とSP2/0ミエロ-マ細胞3×10^7個をPEG法にて細胞融合を行った。スクリ-ニングには自己燐酸化インスリン受容体の免疫沈降を用いた。その結、燐酸化チロシンに対する特異的モノクロナル抗体1D7を得ることができた。この抗体についてその特異性を検討すると、イムノブロッティング法において、インスリン刺激後の細胞において95Kのインスリン受容体βサブユニット,64K,61K,54K,41Kの蛋白を認識し、これらは燐酸化チロシンの存在により消失したが、燐酸化セリン、燐酸化スレオニンの存在では全く影響をうけなかった。以上より、このモノクロナ-ル抗体が、燐酸化チロシンを特異的に認識しているのは明らかである。また、インスリン刺激後に認識されるチロシン燐酸化蛋白についても、昨年度迄に我々が作製したモノクロナル抗体あるいはすでに米国において市販されている抗燐酸化チロシンモノクロナル抗体PY20とかなり異ることが明らかとなった。すなわち,185Kのチロシン燐酸化蛋白は、我々が作製したモノクロナル抗体でよく認識されるが、今回の1D7やPY20ではあまりよく認識されない。一方、I型PIキナ-ゼ活性は、PY20によりよく免疫沈降されるが、1D7ではその10%程度しか免疫沈降されないことが明らかとなった。

This year, when phosphorylated antibodies are produced, they are used as antigens in E. coli. BALB/C mice were immunized with 200 ~ 400μg of E. coli protein on the hind pad for 4 times on the 3rd ~ 4th day. After 4 days of final immunization, 1×10^8 SP2/0 cells were obtained and 3×10^7 cells were fused by PEG method. The immune response of the receptor was investigated. The protein expression of the antibody 1D7 was determined by the specific protein expression. The specificity of the antibody was investigated by the method of phosphorylation, and the effect of phosphorylation on the receptor β-protein at 95K,64K,61K,54K, and 41K was investigated by the method of phosphorylation. The above is a special understanding of the antibody and phosphorylation of the protein. After the stimulation, the phosphorylated protein was recognized. Since last year, we have been working on the anti-phosphorylated protein antibody PY20. 185K Phosphorylated Protein, I, and I are working together to produce antibodies that are recognized today by 1D7 and PY20. 1. Type I PI-1 activity: PY20, PY 7, PY 10, PY 10, PY 10

项目成果

Tashiro-Hashimoto,Y.,Tobe,K.,Koshio,O.,Izumi,T.,Takaku,F.,and Kasuga,M.: "Tyrosine-phosphorylation of pp185 by insulin receptor kinase in a cell free system." (J.Biol.Chem.). 264. 6879-6885 (1989)

Tashiro-Hashimoto,Y.、Tobe,K.、Koshio,O.、Izumi,T.、Takaku,F. 和 Kasuga,M.：“无细胞系统中胰岛素受体激酶对 pp185 的酪氨酸磷酸化。”

Takayama-Hasumi,S.;Tobe,K.;Momomura,K.;Koshio,O.;Tashiro-Hashimoto,Y.;Akanuma,Y.;Hirata,Y.;Takaku,F.;Kasuga,M.: J.Clin.Endocrinal.Metab.(1989)

高山莲见，S.；户部，K.；桃村，K.；小潮，O.；田代桥本，Y.；赤沼，Y.；平田，Y.；高久，F.；春日，M.：J

R.Yamamoto,T.Shiba,K.Tobe,Y.Shibasaki,O.Koshio,T.Izumi,M.Odawara,Y.Mikami,N.Matsuura,Y.Akanuma,F.Takaku,M.Kasuga: "Defect in tyrosine kinase activity of the insulin receptor from a patient with insulin resistance and acanthosis nigricans," J.Clin.Endocrin

R.Yamamoto、T.Shiba、K.Tobe、Y.Shibasaki、O.Koshio、T.Izumi、M.Odawara、Y.Mikami、N.Matsuura、Y.Akanuma、F.Takaku、M.Kasuga：“缺陷

Tashiro-Hashimoto,Y.;Tobe,K.;Koshio,O.;Izumi,T.;Takaku,F.;Akanuma,Y.;Kasuga,M.: J.Biol.Chem.(1989)

田代桥本，Y.；户部，K.；小潮，O.；泉，T.；高库，F.；赤沼，Y.；春日，M.：J.Biol.Chem.(1989)

Odawara,M.,Kadowaki,T.,Yamamoto,R.,Shibasaki,Y.,Tobe,K.,Accili,D.,Bevins,C.,Mikami,Y.,Matsuura,N.,Akanuma,Y.,Takaku,F.,Taylor,S.I.,and Kasuga,M.: "Human diabetes associated with a mutation in the tyrosine kinase domain of the insulin receptor." (Science).

小田原 M.、门胁 T.、山本 R.、柴崎 Y.、户部 K.、阿奇利 D.、贝文斯 C.、三上 Y.、松浦 N.、赤沼 Y.、