好中球遊走機能分子TM316の蛋白一次構造の決定と機能ドメインの検索

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好中球の遊走機能を抑制するモノクローナル抗体であるTM316抗体が認識するcDNAをクローニングし、そのアミノ酸の一次構造を明らかにし、さらに機能ドメインを検索するのが本研究の目的であった。計画調書に記載した如く、昨年度に発現ベクターで作成した好中球cDNAライブラリーとTM316抗体を用いてクローニングした約1400塩基対のcDNAを用いて、本年度はさらに長い約1700塩基対のcDNAをクローニングしたが、最終的にこれらのクローンはTM316分子をコードする遺伝子であることを特定することは出来なかった。すなわち、このcDNAを用いたノーザンブロットの解析では、シグナルは約2000塩基のところに検出され、さらに好中球だけでなく、リンパ球等にも検出されることが判明したからである。TM316抗体は好中球特異的に約150kDaの分子と反応することから、おそらくこのcDNAが規定する蛋白ではないと考えられた。そこで今年度はさらに別のアプローチとして、TM316抗体を用いて、好中球膜分画から免疫沈降法により精製した分子のアミノ酸配列の決定を行なった。まずこの精製分子を直接シークエンサーにて分析したがシグナルが検出されず、N末端がブロックされていると考えられた。そこでV8プロテアーゼ、リシルエンドペプチダーゼなどを用いて精製分子を部分分解し、その分解された断端のN末端をシークエンスすることにした。現在V8プロテアーゼによる2つの断端のN末端8アミノ酸残基及び6アミノ酸残基の配列を決定することが出来ている。コンピューターによる検索では既知の配列ではないことも判明している。今後この配列をプローブとしてcDNAをクローニングしていく予定である。