免疫応答におけるT細胞レセプター・クロノタイプ検出システムの確立と免疫病への応用

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ヒトおよびマウスのT細胞レセプター(TCR)beta鎖について、そのクロノタイプ検出システムの確立をすすめた。方法としては当初行っていたPCRの為のCbetaプライマーに直接ビオチンを標識して、最終的にSSCPにてシグナルを検出をする方法は、PCR反応でTCR以外のシグナルをも増幅してしまうことから特異性の点で問題となった。そこでSSCP泳動後これをナイロンメンブレンに転写し、さらに内側に近接したCbetaプローブでハイブリダイズする方法を確立し、特異性を高めた。さらにバンドとして検出されるTCRクロノタイプの塩基配列決定は、バンドからのDNAの抽出と二次PCR反応の後直接シークエンス法を試みたが、再現性の良い決定は難しいことが判明した。そこで二次PCR産物をプラスミドベクターに組換えクローニングした後、シークエンスを行う方法にを行い、良好な成績を得た。実際の解析の結果では、ヒト、マウスともに、試験管内での特異抗原刺激により、それに反応するクロノタイプがCD4、CD8別にダイナミックに変わっていく状態を検出することが可能となった。またヒト健常人末梢血中のリンパ球はTCRbeta領のクロナリティーからみて限りなくヘテロの集団であるが、その中にCD8陽性のクローンが10個前後安定して存在することも判明した。健常人が感冒に罹患するとその末梢血中に集積しているクローンもダイナミックに変化し、CD4陽性T細胞は反応しクローンを形成する時間及び半減期ともに短く、CD8陽性T細胞は反応も遅いが、血中からの消失にも時間がかかることが明らかとなった。これらの結果をもとに、種々の疾患患者検体及びマウスモデルでのTCRクロノタイプの動きを検討中である。