核骨格の再構成系を用いた核機能の解析

利用核骨架重建系统分析核功能

• 批准号: 06680689
• 负责人: 筒井 研
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06680689/
• 关键词: 核骨格; 核マトリックス; hnRNP複合体; SAR; MAR; RNA合成

我々は核より抽出した可溶性の核タンパク質から核骨格様の不溶性構造(NES)をin vitroで再構成する条件を見出している.本研究ではNESの形成機構と生物活性の解析を進め,核骨格付着領域(SAR)をもつ鋳型DNAとNESを含むin vitro転写系について予備的検討を行った.RNase阻害剤存在下に調製した核抽出液はNES形成条件(42℃,20min)を与えてもNESを作らないことから,NES構成タンパク質の核からの遊離には内在性のRNaseが関与していることが明らかになった.また,核抽出液をショ糖密度勾配遠心により分画すると,SP120(SAR結合タンパク質)は約40SのhnRNP複合体と挙動を共にした.これらの結果はSP120がヒトのhnRNPタンパク質Uと相同である事実と矛盾しない.温度処理(42℃)を行うとすべてのhnRNP複合体は他の数種のタンパク質と共に疑集し,ペレット画分(NES)に移行した.ATPを加えるとNESの形成が著しく促進され,より生理的な条件下(37℃,20min)でNES形成が完了した.ATPはCTPでは代用されず,SP120と125kDのNESタンパク質が核抽出液中のキナーゼで高度にリン酸化されることから,これらのタンパク質のリン酸化がNESの形成に関与する可能性が示唆された.NESは超らせんDNAを特異的に結合し,SAR結合活性やトポイソメラーゼ活性を含め,核骨格標品がもつ生物活性の多くを共有することが確認された.以上の結果より,NESはいわゆるhnRNP複合体を含む内部核マトリックスの再構成系と見なすことができる.in vitro転写反応に用いる鋳型DNAは転写産物の同定を容易にするため,アデノウイルスMLプロモーターの下流にG-freeカセットをもつプラスミド〔pML(C_2AT)_<19>〕を原型とし,この転写単位の上流または下流にリゾチーム,Igκ,fushitarazu遺伝子由来のSARを挿入したものそれぞれ構築した.核抽出液は試行錯誤の結果,Gorskiらの方法でラット肝より調製したものを用いた.通常の転写反応において,SARを挿入した鋳型はすべてpML(C_2AT)_<19>より有意に高い転写効率を示すことが判明した.現在,NESに結合した鋳型による転写反応を解析中であるが,まだ十分な結果は得られていない.

The conditions for the formation of soluble nuclei and insoluble structures (NES) in vitro are discussed. In this study, the mechanism of NES formation and its biological activity were analyzed. The preparation of NES in vitro-containing DNA and NES was studied. The condition of NES formation (42℃,20min) was modulated in the presence of RNase inhibitor. In addition,SP120(SAR-binding protein) and hnRNP complex of about 40S were found in the nuclear extract. The result is SP120, which is the same thing as hnRNP. The temperature treatment (42℃) promoted the formation of NES in the hnRNP complex under physiological conditions.(37℃,20min) The formation of NES was completed.ATP was replaced by CTP, and the NES was highly acidified in the nuclear extract at SP120 and 125kD. The formation of NES was related to the possibility of NES formation. SAR binding activity is determined by the amount of activity, and the amount of biological activity is determined by the amount of activity. As a result, the NES hnRNP complex contains an internal nucleus, and the recombination system is easy to identify.In vitro reverse transcription, it is easy to identify the downstream G-free DNA fragment. In vitro, it is easy to construct the upstream G-free <19>DNA fragment. Nuclear extraction fluid is the result of a trial error,Gorski's method is to use the same method. Usually, the SAR is inserted into the target area, and the pML(C_2AT)_is intentionally high<19>. Now, the NES is combined with the pattern and the result is obtained.

项目成果

M.Watanabe,K.Tsutsui,K.Tsutsui and Y Inoue: "Differential expressions of tepoisnerase IIα and IIβ mRNAs in developing rat brain" Neuroscience Research. 19. 51-57 (1994)

M. Watanabe、K. Tsutsui、K. Tsutsui 和 Y Inoue：“大鼠脑发育中 tepoisnerase IIα 和 IIβ mRNA 的差异表达”《神经科学研究》19. 51-57 (1994)。

K.Akiyama,K.Nagao,T.Oshida,K.Tsutsui,MC.Yoshida,and S.Seki: "Cloning,sequence analysis and chromosomal assignment of the mouse Apex gene" Crenomics. (in press). (1995)

K.Akiyama、K.Nagao、T.Oshida、K.Tsutsui、MC.Yoshida 和 S.Seki：“小鼠 Apex 基因的克隆、序列分析和染色体分配”Crenomics。

Y.Ono,M.Watanabe,Y.Inoue,T.Ohmoto,K.Akiyama,K.Tsutsui,S.Seki: "Developmental expression of APEX nuclease,a multifunctional DNA repair enzyme,In mouse brains" Developmental Brain Research. (in press). (1995)

Y.Ono、M.Watanabe、Y.Inoue、T.Ohmoto、K.Akiyama、K.Tsutsui、S.Seki：“APEX 核酸酶（一种多功能 DNA 修复酶）在小鼠大脑中的发育表达”发育性大脑研究。