Control of immune responses via spatiotemporal regulation of mRNA decay

１．Regnase-1複合体による免疫シグナル受容機構の解明；　Regnase-1はサイトカインなどのmRNA分解に重要であるが、その過程でリン酸化UPF1とRegnase-1が結合することが重要であることを明らかにしてきた。本研究では、まず、マクロファージをLPSで刺激すると、UPF1のT28リン酸化が誘導されていることを見出した。このリン酸化はT28に特異的であり、UPF1のC末端領域のリン酸化には変化を認めなかったことから、シグナル伝達の過程で、UPF1のT28リン酸化が特異的に誘導されていることが明らかとなった。２．Regnase-1およびRoquin時空間制御機構の解析；Regnase-1とRoquinはRNAと複合体を形成し機能しているが、免疫応答における各時期に、それぞれ他のどのような蛋白質と複合体を形成し機能しているのかは不明である。そこで、Regnase-1やRoquinに結合する蛋白質をビオチン化し質量分析を用いて網羅的に解析するBioID法を利用した。このために、Regnase-1と近接した蛋白質をビオチン化するため、BirAとRegnase-1に付加した蛋白質を発現させるベクターの作出に成功し、HEK293細胞においてこのプラスミドが発現することを確認した。3．免疫応答の転写後制御に関わる新規機能分子の同定； IL6の3’UTRをモデルにCRISPR-Cas9を用いたスクリーニングにより新たな転写後制御分子の同定を試みた。蛍光蛋白質であるLssmOrangeとEGFPを同一プロモーター下で双方向に転写し、EGFP遺伝子の下流にのみIL6の3’ UTRを導入したレポーターを発現するベクターの作製に成功した。また、Cas9発現K562細胞、および、gRNAライブラリー導入のシステムも確立した。

１．Regnase-1複合体による免疫シグナル受容機構の解明；　Regnase-1はサイトカインなどのmRNA分解に重要であるが、その過程でリン酸化UPF1とRegnase-1が結合することが重要であることを明らかにしてきた。本研究では、まず、マクロファージをLPSで刺激すると、UPF1のT28リン酸化が誘導されていることを見出した。このリン酸化はT28に特異的であり、UPF1のC末端領域のリン酸化には変化を認めなかったことから、シグナル伝達の過程で、UPF1のT28リン酸化が特異的に誘導されていることが明らかとなった。２．Regnase-1およびRoquin時空間制御機構の解析；Regnase-1とRoquinはRNAと複合体を形成し機能しているが、免疫応答における各時期に、それぞれ他のどのような蛋白質と複合体を形成し機能しているのかは不明である。そこで、Regnase-1やRoquinに結合する蛋白質をビオチン化し質量分析を用いて網羅的に解析するBioID法を利用した。このために、Regnase-1と近接した蛋白質をビオチン化するため、BirAとRegnase-1に付加した蛋白質を発現させるベクターの作出に成功し、HEK293細胞においてこのプラスミドが発現することを確認した。3．免疫応答の転写後制御に関わる新規機能分子の同定； IL6の3’UTRをモデルにCRISPR-Cas9を用いたスクリーニングにより新たな転写後制御分子の同定を試みた。蛍光蛋白質であるLssmOrangeとEGFPを同一プロモーター下で双方向に転写し、EGFP遺伝子の下流にのみIL6の3’ UTRを導入したレポーターを発現するベクターの作製に成功した。また、Cas9発現K562細胞、および、gRNAライブラリー導入のシステムも確立した。