Development of Molecules Inducing Disruption of Cell Membrane Asymmetry and Search for Endoplasmic Reticulum Lipid Scrambling Factors

诱导细胞膜不对称性破坏的分子的开发和内质网脂质扰乱因子的寻找

基本信息

批准号：
22H02194
负责人：
中野実
金额：
$ 11.32万
依托单位：
University of Toyama
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2026-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

膜貫通配列の中央に親水性のグルタミン(Q)を１残基有し、N末端に親水性配列(RRRR)を有するペプチド4RQをFmoc固相合成法により合成した。このペプチドが添加により速やかにリン脂質ベシクルに組み込まれ、リン脂質のフリップフロップを促進することを、NBD脂質を用いた蛍光消光法により明らかにした。培養細胞に4RQを添加すると、通常は細胞膜の内層に局在するホスファチジルセリン(PS)が外層に露出することが判明し、ペプチドが細胞膜リン脂質のフリップフロップを促進したことが示唆された。次に、さらに高い活性をもつPS露出ペプチドの開発の検討を行った。リン脂質ベシクルを用いたNBD蛍光消光法の結果、２つの親水性残基を膜貫通ヘリックスの同一面上にもつペプチド4RRHおよび4R2Qが、4RQよりも高いフリップフロップ促進能を有することを示した。ペプチドのPS露出活性をHEK293細胞を用いてフローサイトメトリーにより評価したところ、4RQによりPSを表出した細胞の割合は約20％であったのに対し、4R2Qと4RRHによりPSを表出した細胞はそれぞれ約40％、50％であった。このことから、4RRHおよび4R2Qはスクランブラーゼ様の活性をもち、これらを細胞に添加すると人工的にPSの表出を誘起できることが明らかになった。興味深いことに、ペプチドを添加した細胞において、細胞膜から小胞が生成される様子が観察された。スクランブラーゼの作用によって同様の現象が起こることが知られていることから、ペプチドのスクランブラーゼ様の活性がこの現象を引き起こしたと考えられる。

FMOC固相合成合成了肽4RQ，在跨膜序列中心具有一个残基，在跨膜序列中心和N末端中的亲水性序列（RRRR）中，由FMOC固相合成合成。通过使用NBD脂质进行荧光淬灭揭示了该肽在添加后迅速掺入磷脂囊泡中，并促进磷脂的触发器。在培养的细胞中添加4RQ表明通常将磷脂酰丝氨酸（PS）定位在细胞膜的内层，暴露于外层，这表明肽促进了细胞膜磷脂的触发器。接下来，我们研究了PS暴露的肽的发展，其活性甚至更高。使用磷脂囊泡进行NBD荧光淬灭，表明肽4RRH和4R2Q在跨膜螺旋的同一平面上具有两个亲水性残基，比4RQ具有更高的flip-flop-gromentancing能力。当使用HEK293细胞通过流式细胞仪评估肽的PS暴露活性时，通过4RQ表达PS的细胞的比例约为20％，而大约40％和50％的细胞通过4R2Q和4RRH表达PS的细胞分别为40％和50％。这表明4RRH和4R2Q具有类似乱囊的活性，当这些活性添加到细胞中时，它们可以人为地诱导PS的表达。有趣的是，观察到囊泡是由细胞中的细胞膜产生的，并添加了肽。众所周知，类似的现象是由于Scramblase的作用而引起的，并且认为肽的cramblase样活性引起了这种现象。