大腸菌RecA蛋白質によるヌクレオフィラメント形成機構の解析

大肠杆菌RecA蛋白核丝形成机制分析

• 批准号: 03267203
• 负责人: 堀井 俊宏
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1991
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1991 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-03267203/
• 关键词: RecA蛋白質; 相同的組換え; DNA結合蛋白質; DNA結合部位; 部位特異的変異導入; DNA binding wing; クロスリンク

大腸菌RecA蛋白質は、試験管内で相同な二種のDNAからヘテロ二重鎖を形成することから、生物によく見られる組換え現象をDNAと蛋白質との相互作用として理解するためのモデルケ-スとして重要である。RecA蛋白質の行なうヘテロ二重鎖形成反応を理解するためには、RecA蛋白質がATP存在下で単鎖DNAと科学量論的に結合して形成される、ヌクレオフィラメントの構造解明が必須である。しかし、RecA蛋白質のどの領域がDNA結合部位であるのかさえ分かっていない。そこで我々は、DNA結合部位の決定を試みた。DNA結合に直接関与する領域を同定するため、部位特異的変異導入によりDNA結合部位の候補となる領域に変異を導入し、15種類の変異体を得た。生体内で、得られた変異型recA遺伝子の機能を調べ、その機能が野生型と比べて大きく低下していたものについて、それぞれの変異型蛋白質を精製し、試験管内で生化学的に解析した。DNA結合能及び、RecAーReca勇互作用能を調べた結果、1)RecAーR243Aは、DNA結合部位に変異を持っている 2)RecAーY264Aは、RecAーRecA相互作用部位に変異を持っている 3)RecAーK6AーK23Aは、DNA結合能が正常であることが示唆された。一方、RecA蛋白質と単鎖DNAとの間で、紫外線によるクロスリンクを行なった。クロスリンクされたRecA蛋白質をプロテア-ゼで限定分解し、DNAーペプチド複合体を解析した結果、Lys250及びLys183の周辺のペプチドが、DNAにクロスリンクされていたことがわかった。RecA蛋白質のArg243及び、Lys250を含む領域は、他の単鎖DNA結合蛋白質に見られるDNAbinding wingと呼ばれるDNA結合部位のモチ-フと非常に高い相同性があり、これらの結果は、RecA蛋白質においても、DNAbinding wingがDNA結合部位であることを強く示唆する。

E. coli RecA protein is important for understanding the interaction between DNA and protein in the same two DNA double locks in the same tube. RecA protein binding to DNA in the presence of ATP is a necessary part of the structure of the protein. The domain of RecA protein is DNA binding site. DNA binding sites are determined by DNA binding sites. DNA binding is directly related to the domain identity, site-specific variant introduction, DNA binding site candidate, domain variant introduction, 15 species variant introduction In vivo, the function of different recA proteins is modulated, and the function of different recA proteins is reduced from wild-type to large-type. In vivo, different recA proteins are purified and analyzed in vitro. DNA binding energy and RecA-RecA interaction energy are modulated as follows: 1)RecA-R243A is different from the DNA binding site; 2)RecA-Y264A is different from the RecA-RecA interaction site; 3)RecA-K6A-K23A is normal; One side, RecA protein, DNA, ultraviolet light, etc. RecA protein was analyzed by restriction enzyme, DNA complex was analyzed by restriction enzyme, Lys250 and Lys183 were analyzed by restriction enzyme, DNA complex was analyzed by restriction enzyme. RecA protein contains Arg243 and Lys250 in the domain of DNA binding protein, and other DNA binding proteins in the domain of DNA binding wing.

项目成果

Toshihiro Horii,Naoki Ozawa,Tomoko Ogawa and Hideyuki Ogawa: "Inhibitory effects of Nーand Cーterminal truncated E colirecA gene products on function of wildーtype recA gene." Journal of Molecular Biology. 223. 105-114 (1992)

Toshihiro Horii、Naoki Ozawa、Tomoko Okawa 和 Hideyuki Okawa：“N 端和 C 端截短的大肠杆菌ecA 基因产物对野生型 recA 基因功能的抑制作用。” 分子生物学杂志 223. 105-114 (1992)。

Satoshi Tateishi,Toshihiro Horii,Tomoko Ogawa and Hideyuki Ogawa: "Cーterminal truncated E.coli RecA protein,RecA5327,has enhanced binding affinities to singleーand doubleーstranded DNA." Journal of Molecular Biology. 223. 115-129 (1992)

Satoshi Tateishi、Toshihiro Horii、Tomoko Okawa 和 Hideyuki Okawa：“C 端截短的大肠杆菌 RecA 蛋白 RecA5327 与单链和双链 DNA 的结合亲和力增强。” 分子生物学杂志 223. 115-129（ 1992）