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蛋白質の細胞内輸送に関与する酵母Usol遺伝子産物の解析

参与细胞内蛋白质转运的酵母 Usol 基因产物分析

基本信息

批准号：
03264205
负责人：
依田幸司
金额：
$ 0.96万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1991
资助国家：
日本
起止时间：
1991 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-03264205/
关键词：
酵母細胞内輸送 Usol遺伝子

项目摘要

酵母のUsol蛋白は1790アミノ酸よりなる大分子量の親水性蛋白で、カルシウム結合配列をもちC末端側約半分でαヘリックスのcoiled coil二量体を形成していると予想されている。温度感受性uso1変異株では制限温度で小胞体からゴルジ体への蛋白質細胞内輸送が止まり核や小胞体の構造異常化がおこることから、Usol蛋白は小胞体ーゴルジ体間の小胞輸送に関与する。Usol蛋白の機能を明らかにするため、抗Usol抗体を用いてUsol蛋白の形状と局在性について検討を行なった。大腸菌で生産して2種のUsol部分融合蛋白或いはカルシウム結合配列を含む合成ペプチドを抗原として得た3種の抗体はいずれも、酵母菌体破砕液をSDS/PAGEで分画してWestern blotすると、同じ200Kの蛋白質と反応した。200Kの蛋白はCoomassie blue染色でも検出されるので比較的多量に酵母に存在する蛋白である。いずれの抗体も酵母細胞破砕液から未変性のUsol蛋白を直接に沈降させることはできず、免疫沈降にはSDS等による変性が必要であった。約200Kの分子量の抗Usol抗体と反応する蛋白のSDS/PAGEでの挙動は、菌体破砕液の調製法によって変化し、溶菌酵素でスフェロプラスト化してから破砕した場合は1本だが、集菌した細胞を直接ガラスビ-ズで破砕したときには2本認められた。スフェロプラスト化は細胞の諸活性を低下させるので、Usol蛋白のリン酸化等による修飾の有無がバンドの数に反映されている可能性が考えられる。Usol蛋白の細胞内局在性を調べるために遠心分画すると、いずれの調製法で調製した溶菌液の場合も、10,000xg,60分の遠心では完全に上清にあり、100,000xg,60分の遠心ではおよそ半分が沈殿に、残りは上清の下の方にあった。界面活性剤によりこの分布は影響を受けないことから、沈降は膜成分との結合によるのではない。このことはUsol蛋白が細胞内でなんらかの構造体を形づくって働いていることを示唆している。

Yeast Usol protein 1790 amino acid, large molecular weight hydrophilic protein, complex binding sequence, about half of the C-terminal side, α-complex coiled coil dimer formation Temperature sensitive uso1 mutants limit the intracellular transport of proteins in microsomes and prevent structural abnormalities in nuclear microsomes. Usol proteins are associated with intercellular transport in microsomes. The function of Usol protein is clearly defined, and the use of anti-Usol antibodies is discussed in the shape and nature of Usol protein. E. coli produces two kinds of Usol partial fusion proteins or two kinds of Usol partial fusion proteins or two kinds of Usol partial fusion proteins, three kinds of antibodies and three kinds of Usol partial fusion proteins. 200K protein was detected by Coomassie blue staining and compared with the presence of protein in yeast. In the middle of the antibody, yeast cell lysis solution, undifferentiated Usol protein, direct sedimentation, immunosedimentation, SDS, etc., are essential. SDS/PAGE of anti-Usol antibody with molecular weight of about 200K and preparation method of bacterial disruption solution The activity of Usol protein was decreased, and the possibility of Usol protein acidification was examined. Usol protein in the cellular regulation of the central part of the preparation method to prepare the lysate, 10,000 xg,60 minutes of the central part of the complete supernatant, 100,000 xg, 60 minutes of the central part of the central part of the semi-supernatant, residual supernatant below the side. Interfacial active agent distribution is affected by precipitation and film composition combination. The protein Usol forms a structural component in the cell.