酵母による細胞質遺伝子工学の創製

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本研究で計画した細胞質遺伝子工学とは、真核細胞において、対象とする遺伝子を核に移行させず細胞質中に保持して大腸菌制御系等を基に発現制御させる技術のことである。酵母Saccharomycescerevisiaeをモデル真核生物として、その細胞質で複製可能なKluyveromyces lactis由来の線状DNAキラー・プラスミドpGKL1(8,874bp)を発現ベクターとして改良することとした。熊本工業大学の郡家徳郎教授らにより、細胞質にあるpGKL1 DNAについて核内で起こるのと同じ相同組換えが起こること、またキラー毒素蛋白質サブユニットをコードするORF2の大部分をLEU2遺伝子と置換えたpJKL1を作ることによってleu2-3,2-112変異を相補できることが、1991年に示されている。pGKL1にあるあと3つのopenreading frameのうち、ORF1は必須なDNAポリメラーゼをコードしているので手を加えられないが、耐性に関わるORF3とキラー毒素γサブユニットをコードするORF4は転写・翻訳開始配列として加工利用できると考えた。平成8年度は、pJKL1を鋳型としたPCRにより、種々のDNA断片を調製し、URA3遺伝子のORFをORF3のプロモーターで転写発現するようにつなぎ合わせ、leu2の相補性で形質転換し、ura3変異も相補する組換え体を得た。組換え体の生育が野生型酵母に比べて著しく遅いので、本年度はまず詳細なDNAの構造解析を行い、予定された構造のものが正しくできていることを確認した。従って転写・翻訳効率が極めて低いと予想されたので、T7ファージRNAポリメラーゼ遺伝子を発現ユニット内に導入し、転写をその支配下におこなうベクターを大腸菌プラスミド上で構築した。転写・翻訳の効率を定量的に測定するため、K.lactisのLAC4遺伝子をマーカーとしてもたせた。次いで、形質転換後の組換体がキラー感受性になり培地にあるキラーで殺されるのを防ぐために、線状プラスミド全長をクローン化して、非キラー酵母に形質転換しうる系も構築した。これらの評価を今後行なう