神経栄養因子欠乏による神経細胞死の機序

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神経細胞は発生過程でその約50%の細胞が脱落する事が知られており、これを自然に起こる神経細胞死と呼んでいる。この神経細胞死は、標的細胞により分泌される神経栄養因子の限定的供給による競合過程の結果であると考える根拠が蓄積されている。特に最近種々の系においてこの細胞死が積極的な過程からなることが示唆され、プログラム神経細胞死として、そのカスケードの解明が重要な課題となっている。ラット新生児上頸神経節神経節細胞を1週間NGF存在化で培養した後、培地中に抗NGF抗体を加えNGFを除去すると、細胞死が起こり、死細胞の割合は2日後には80-90%に達すること、シクロヘキシミド(CHX)やアクチノマイシンD(ACD)により細胞死は阻止されることから最も良いモデルと考えられる。しかし、細胞内カスケードや細胞死関連蛋白質(DAP)を同定、単離するにはもっと多量に試料を調整出来るシステムが望ましい。我々はPC12細胞をNGF処理して分化させるとNGF除去に応答して細胞死が起こることを見いだした。この細胞死はACD、FGF、cAMP、高K+培地で抑えられるが、EGFやTPA等では抑えられないので、血清除去によるPC12細胞死とは異なり、transcription依存的であり、モデルとして有用と考えた。NGF除去により引き起こされる細胞内カスケードを調べる目的で、NGF除去後経時的に細胞を可溶化し、SDS-PAGEを行い、抗phosohotyrosine抗体を用いてWestern Blottingを行うと、p120,p90,p73,p53の主要なチロシンリン酸化蛋白質に脱リン酸化が起こることが判った。NGFを加えた時に顕著に活性化されることが知られているMAPKp44、p42活性は低く、このカスケードは関与していないと思われる。一方SDS-PAGE後の転写膜を用いてkinase活性をrenaturationする方法で自己リン酸化能を調べると、NGF除去に伴って主要なリン酸化活性(Ser/Thr)が徐々に減少することが判った。これらの脱リン酸化カスケードが直接細胞死を導くのか不明であるが、この脱リン酸化反応経過はCHXやACD処理で遅れることから、なんらかの制御された過程であると考えられる。