膜脱分極による遅延性遺伝子発現制御機構

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膜脱分極によるカルシウム流入は神経細胞の生存機能を維持し、神経細胞死を制御している。従来、我々は脱分極剤の効果とその機構及び細胞の成熟分化との関連について検討し、神経細胞の生存への栄養因子要求性と細胞内カルシウム濃度との関係について、"カルシウムセットポイント仮説を"を提唱した。神経活動は形成されたシナプス結合回路の長期にわたる安定性を制御しているという立場から、さらに転写レベルによる長期の制御機構があるのか又はあるとすればどのような機構かを調べる必要がある。この為、本年度は脱分極作用による生存促進効果が知られている小脳顆粒細胞培養系を用い、この系の特徴を調べた。生後7日のラット小脳から顆粒細胞を分離培養した。分離した時点ではまだ細胞増殖をしており、2-3DIVには突起をのばして分化を始める。更に通常の培養条件では5DIVには細胞死が始まり、7DIVでは完全に死滅する。この細胞死はシクロヘキシミドやアクチノマイシンDで抑制される積極的な細胞死であること及びBDNF(IC50=2.5nM)で抑制されることを示した。更に、trkBの存在はNorthern blot、RT-PCR法で調べ、更にanti-trkB抗体を用いたimmunoblotで確かめた。これらのことから小脳顆粒細胞のin vitroモデルは細胞分化、細胞死を研究する良い系であることが判った。この系では高カリウム培地やNMDAなどの脱分極作用が細胞死を阻止することが知られているが、カルシウムセットポイント仮説を中枢の神経細胞で調べる良い系と考え、顆粒細胞の生存と細胞内カルシウムとの相関を明らかにした。更にこの系及び上頸神経節細胞を用いて、脱分極剤により発現制御される遺伝子をD D法及びRAP法により多数拾い、さらに単離及びヌクレオチド配列決定を試みている。