カルシウム結合蛋白質の金属配位構造の安定性とその動的構造変化

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カルモデュリンにカルシウムイオン(Ca)が結合すると高次構造が変わり、これが標的酵素の活性化に重要な役割を持っている。Ca結合により、カルモデュリン分子のC末端側1/2(Cドメイン)に誘起される高次構造変化の実体をとらえることを試みた。(1)脊椎動物カルモデュリンのTyr138(ドメインIV)はGlu82(ドメインIII)と水素結合しており、これがCドメインの高次構造変化の鍵を握っている可能性が考えられる。酵母カルモデュリンの同じ位置はIle138なので、この水素結合は考えられない。Ile138をTyrに置換した変異体(YCMY,YCMDY)をつくった。その結果、Tyr138を導入してもPDEの活性化能の改善はみられなかった。Ca結合によるTyr138の紫外吸収差スペクトルを比較すると、いずれも鶏カルモデュリン同様にブルーシフトを示したが、YCMY、YCMDYは286nmの谷が288nmの谷よりも小さく、鶏カルモデュリンのCドメインの高次構造とは微妙に異なることが明らかになった。水素結合が形成されると、鶏カルモデュリンのように286nmの谷がより深い形になるのではないかと推定して、これを確認する実験法を考えている。DELTA A288のCa滴定結果から、高いPDE活性化能を示すものでは、Caの最大結合数(3または4モル)によらず、Caは、まずCドメインに結合するという傾向が得られた。Cドメインへの優先的なCa結合がPDEとの強い結合に重要であると考えられる。実験例数を増やしてはっきりとさせたい。(2)酵母カルモデュリン(YCMO)と、Caを4モル結合する変異カルモデュリン(YCMD)について1H-NMRスペクトルを測定して比較し、Ca結合に伴うCドメインの高次構造変化について検討した。(3)Ca結合に伴うグローバルな構造変化を知るために、キメラカルモデュリン(C4Y,C4Y140E)をもちいて、溶液X線小角散乱法による研究を試みた。