血友病Bのレトロウイルスベクターによる遺伝子治療に関する基礎的研究

逆转录病毒载体治疗B型血友病基因治疗的基础研究

• 批准号: 05253208
• 负责人: 斎藤 英彦
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05253208/
• 关键词: 遺伝子治療; 血友病B; レトロウイルスベクター

第IX因子のcDNAをレトロウイルスベクターpLRNLに組み込んでpL9RNLを作製し、ヘルパー細胞GP+E86(ectropic)、PA317(amphotropic)に移入し、producer細胞GP+E86/L9RNL,PA317/L9RNLを樹立した。樹立されたproducer細胞の培養上清をラット208F細胞、およびマウスNIH3T3細胞に感染させ、2週間後のG418resistant colonyの数にてvirus titerを測定した。その結果GP+E86/L9RNL,PA317/L9RNLともに約10^3〜10^4/mlのtiterであった。またNIH3T3細胞、208F細胞において得られたコロニーはそのまま組み換え蛋白質産生細胞として用いた。以上3種類の細胞株各1×10^6個あたり24時間に産生される第IX因子量をEIAにて測定した(なお培養液中にVitaminKを500ng/mlの濃度で添加した)。その結果500ngから1.2μgの第IX因子が上清中に産生されていた。また、上清中の第IX因子活性を凝固一段法にて測定し、比活性で表した。いずれの細胞においても90%以上の比活性が得られ、細胞内における蛋白の翻訳後修飾は正常に行なわれていることが示唆された。培養上清を集めてWestern blottingを行なったところヒト血漿由来の第IX因子と同じ分子量約54,000のバンドを検出し、ほぼ正常な第IX因子が産生されていることがわかった。遺伝子治療のターゲット細胞としては遺伝子産物の翻訳後修飾が正常に行なわれる細胞でなければならない。今回検討したマウス線維芽細胞は十分な量の第IX因子を産生し、比活性がほぼ100%であったこと、またバリウム吸着法にて沈殿した蛋白質が正常と等しい分子量を有していたことなどより翻訳後修飾はヒトの生理的条件に近く行なわれたものと考えられる。

Factor IX: cDNA

项目成果

Hasegawa,Y.: "Gene transfer of herpes simplex virus type I thymidine kinase gene as a drug sensitivity gene into human lung cancer cell lines using retroviral vectors." Am J Respir Cell Mol Biol. 8. 655-661 (1993)

Hasekawa,Y.：“使用逆转录病毒载体将单纯疱疹病毒 I 型胸苷激酶基因作为药物敏感性基因转移到人肺癌细胞系中。”

Miyamura,K.: "Long persistent bcr-abl positive transcript detected by polymerase chain reaction after marrow transplant for chronic myelogenous leukemia without clinical relapse:A study of 64 patients." Blood. 81. 1089-1093 (1993)

Miyamura,K.：“慢性粒细胞白血病骨髓移植后通过聚合酶链反应检测到长期持续的 bcr-abl 阳性转录本，无临床复发：一项针对 64 名患者的研究。”

Yamazaki,T.: "A phenotypically neutral dimorphism of protein S:the substitution of Lys155 by Glu in the secondEGF domain predicted by an a to G base exchange in the gene." Thromb Res. 70. 395-403 (1993)

Yamazaki,T.：“蛋白质 S 的表型中性二态性：通过基因中的 a 到 G 碱基交换预测，第二个 EGF 结构域中的 Lys155 被 Glu 取代。”

Matsushita,T.: "Construction and its expression of a new retroviral vector containing a human blood coagulation factor IX cDNA." Thromb Res. 69. 387-393 (1993)

Matsushita,T.：“含有人凝血因子 IX cDNA 的新型逆转录病毒载体的构建及其表达。”

Yamamoto,K.: "Impaired secretion of the elongated mutant of protein C(protein C-Nagoya):Molecular and cellular basis for hereditary protein C deficiency." J Clin Invest. 90. 2439-2446 (1993)

Yamamoto,K.：“蛋白 C 延长突变体（蛋白 C-名古屋）的分泌受损：遗传性蛋白 C 缺乏症的分子和细胞基础。”