血管における内皮依存性NO生成酵素誘導の機構

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本研究では、血管を構成する細胞のうち内皮細胞および平滑筋細胞につき、誘導型NO生成酵素(iNOS)の発現条件を検討した。ラット大動脈内皮細胞および平滑筋細胞を継代培養した。内皮細胞では、ラットインターフェロン-gamma(IEN-gamma)、ヒト腫瘍壊死因子(TNF-alpha)、LPSの組み合わせで48時間まで刺激し、上清中の硝酸イオンおよび亜硝酸イオン(NOx)濃度をグリース法を用いて定量した。平滑筋細胞では、ヒト腫瘍壊死因子(TNF-alpha)、ヒトインターロイキン1alpha(IL-1alpha)あるいはIL-1beta、LPSで刺激した。細胞収集後、mRNAを抽出し、ラット肝iNOScDNAの700bp断片をプローブとしてノーザンブロットを行なった。細胞培養液、添加試薬は実験前にLPS濃度を測定した。全ての実験で実験系に混入したLPS濃度は20pg/ml未満であった。内皮細胞においては、IFN-gamma(100U/ml)、TNF-alpha(5000U/ml)、LPS(100ng/ml)の単独処置では、48時間までNOx産生を示さなかった。IFN-gammaおよびTNF-alpha同時処置で時間依存性にNOx産生及びiNOSmRNA増加がみられ、IFN-gammaとLPS、TNF-alphaとLPSの組み合わせもNOx、iNOSmRNAを増加させ、三者を同時に加えると相乗的に非常に強い強い誘導能を示した。平滑筋細胞においては、TNF-alpha、IL-1alpha、LPS単独処置では、48時間までNOx産生を示さなかった。IL-1beta単独処置でわずかにNOx産生がみられた。LPSおよびTNF-alpha、TNF-alphaおよびIL-1alpha、あるいはTNF-alphaおよびIL-1beta同時処置で時間依存性にNOx産生がみられた。内皮細胞とは異なり、サイトカインの組み合わせ(TNF-alphaおよびIL-1beta)で誘導されたNOx産生はLPSをさらに添加してもそれ以上の誘導は起きなかった。