ガングリオシドと細胞骨格タンパク質の相互作用の機構解明に関する研究

阐明神经节苷脂与细胞骨架蛋白相互作用机制的研究

基本信息

批准号：
05274104
负责人：
細谷浩史
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05274104/
关键词：
細胞骨格ガングリオシド GM2 微小管 Tay-Sachs細胞

项目摘要

(1)培養Tay-Sachs細胞およびGM2に対するモノクローナル抗体を使用し、間接蛍光抗体法によってGM2の細胞内局在を検討した。観察には、通常の蛍光顕微鏡及びレーザースキャン顕微鏡の両方を併用した。その結果、細胞内に多数のベシクル状の染色像が観察され、また、その周辺に繊維状の染色像が常に観察された。細胞の固定法には、(1)フォルマリン水溶液、(2)パラフォルムアルデヒド、(3)グルタールアルデヒド、(4)メタノールなどを用いたが、(1)および(4)を用いた固定の場合のみ、上記のベシクル状及び繊維状の構造の両方が明瞭に観察された((4)による固定は、微小管の構造保持に最も適していることが分かっている)。(2)次に、(1)で観察された繊維状の染色像が、細胞骨格構造かどうかを、GM2とチューブリンに対するモノクローナル抗体を用いた二重染色法により検討した。その結果、これらの繊維状構造は両抗体により二重染色されることが明らかになった。(3)(2)で観察された繊維状構造が微小管かどうかをさらに明確にするために、ノコダゾール(微小管を破壊し、数を少なくする)およびビンブラスチン(微小管の"結晶構造"を細胞内に作る)をTay-Sachs細胞に作用させ、(2)と同様に二重染色法により観察を行った。その結果、これらの操作により改変された微小管構造は、全てGM2抗体により染色され、細胞内で微小管とGM2が共局在していることが明らかにされた。(4)次に、タクソールを用いてTay-Sachs細胞から微小管を直接単離し、GM2が結合しているかどうかを検討した。その結果、ELISA法およびウェスタンブロッティング法により、単離・精製された微小管からGM2が検出された。また精製されたチューブリンダイマーにタクソールを加えて再構成した微小管に、外からGM2を加えたところ、GM2は微小管と結合することが明らかになった。

（1）通过使用针对培养的Tay-SACHS细胞和GM2的单克隆抗体和GM2，通过间接荧光免疫吸附测定和GM2研究了GM2的细胞内定位。常规的荧光显微镜和激光扫描显微镜均用于观察。结果，在细胞中观察到许多囊泡状染色图像，并在细胞周围不断观察纤维染色图像。使用的细胞固定方法（1）福尔马林水溶液，（2）多聚甲醛，（3）戊二醛，（4）甲醇等，但是上述囊泡样和纤维结构都清楚地观察到仅在使用（1）和（4）（4）的固定固定时，仅在固定时才观察到，该结构适用于（4）的固定液，该结构是不断的。（2）接下来，使用对GM2和微管蛋白的单克隆抗体进行双染色，研究了（1）中观察到的纤维染色图像是细胞骨架结构。结果，揭示了这些纤维结构用两种抗体进行双染色。为了进一步阐明（3）和（2）中观察到的纤维结构是否是微管，诺科唑（摧毁微管并减少数量）和长天桥（在细胞内部微管的“晶体结构”）和在Tay-Sachs细胞中应用于Tay-Sachs细胞，并且通过双重构成（2）的方式（2）（2）。结果，所有通过这些过程修饰的微管结构均用GM2抗体染色，表明微管和GM2在细胞内共定位。（4）接下来，使用紫杉醇直接从Tay-Sachs细胞中分离出微管，以确定GM2是否结合。结果，通过ELISA和Western印迹在分离和纯化的微管中检测到GM2。此外，当将GM2添加到微管中通过将紫杉醇添加到纯化的小管蛋白二聚体中重组时，据揭示GM2与微管结合。