ガングリオシドと細胞骨格タンパク質の相互作用の機構解明に関する研究

阐明神经节苷脂与细胞骨架蛋白相互作用机制的研究

• 批准号: 05274104
• 负责人: 細谷 浩史
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Hiroshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05274104/
• 关键词: 細胞骨格; ガングリオシド; GM2; 微小管; Tay-Sachs細胞

(1)培養Tay-Sachs細胞およびGM2に対するモノクローナル抗体を使用し、間接蛍光抗体法によってGM2の細胞内局在を検討した。観察には、通常の蛍光顕微鏡及びレーザースキャン顕微鏡の両方を併用した。その結果、細胞内に多数のベシクル状の染色像が観察され、また、その周辺に繊維状の染色像が常に観察された。細胞の固定法には、(1)フォルマリン水溶液、(2)パラフォルムアルデヒド、(3)グルタールアルデヒド、(4)メタノールなどを用いたが、(1)および(4)を用いた固定の場合のみ、上記のベシクル状及び繊維状の構造の両方が明瞭に観察された((4)による固定は、微小管の構造保持に最も適していることが分かっている)。(2)次に、(1)で観察された繊維状の染色像が、細胞骨格構造かどうかを、GM2とチューブリンに対するモノクローナル抗体を用いた二重染色法により検討した。その結果、これらの繊維状構造は両抗体により二重染色されることが明らかになった。(3)(2)で観察された繊維状構造が微小管かどうかをさらに明確にするために、ノコダゾール(微小管を破壊し、数を少なくする)およびビンブラスチン(微小管の"結晶構造"を細胞内に作る)をTay-Sachs細胞に作用させ、(2)と同様に二重染色法により観察を行った。その結果、これらの操作により改変された微小管構造は、全てGM2抗体により染色され、細胞内で微小管とGM2が共局在していることが明らかにされた。(4)次に、タクソールを用いてTay-Sachs細胞から微小管を直接単離し、GM2が結合しているかどうかを検討した。その結果、ELISA法およびウェスタンブロッティング法により、単離・精製された微小管からGM2が検出された。また精製されたチューブリンダイマーにタクソールを加えて再構成した微小管に、外からGM2を加えたところ、GM2は微小管と結合することが明らかになった。

(1) develop Tay Sachs - cell お よ び GM2 に す seaborne る モ ノ ク ロ ー ナ ル antibodies を use し, indirect 蛍 light method に よ っ て GM2 の cells inside bureau in を beg し 検 た. 観 examine に は, usually の 蛍 light 顕 micro mirror and び レ ー ザ ー ス キ ャ ン 顕 micromirror の struck party を and し た. そ の results, intracellular に most の ベ シ ク ル shape の dyeing like が 観 examine さ れ, ま た, そ の weeks 辺 に 繊 d shape の dyeing like が often に 観 examine さ れ た. Cell の fixed method に は, (1) フ ォ ル マ リ ン aqueous solution, (2) パ ラ フ ォ ル ム ア ル デ ヒ ド, (3) グ ル タ ー ル ア ル デ ヒ ド, (4) メ タ ノ ー ル な ど を with い た が, (1) お よ び (4) を い た fixed の situation の み, written の ベ シ ク ル and び 繊 d shape の tectonic の struck party が clear に 観 examine さ れ た ((4) The による is fixed, and the microtubule <s:1> structure is maintained to be に optimal, <s:1> て, る, <s:1>, とが,, って, る. に, (2) time (1) で 観 examine さ れ た 繊 d like が の dyeing, cell skeleton structure か ど う か を and GM2 と チ ュ ー ブ リ ン に す seaborne る モ ノ ク ロ ー ナ を ル antibody with い た double staining に よ り beg し 検 た. Youdaoplaceholder0 そ results, <s:1> れら 繊 繊 dimensional structure そ two antibodies によ <s:1> double staining される とが とが bright ら になった になった になった. (3) and (2) で 観 examine さ れ た 繊 d structure が tiny tube か ど う か を さ ら に clear に す る た め に, ノ コ ダ ゾ ー ル (tiny tubes を broken 壊 し, less number を な く す る) お よ び ビ ン ブ ラ ス チ ン (tiny tubes の "crystal structure" を に る) in the cell を Tay Sachs - cells に さ せ, (2) と with others に double staining method Youdaoplaceholder0 によ 観 examine を lines った. そ の results, こ れ ら の operation に よ り change - さ れ た は tiny tube structure, the whole て GM2 antibody に よ り dyeing さ れ, intracellular で tiny tubes と GM2 が total bureau in し て い る こ と が Ming ら か に さ れ た. に, (4) times タ ク ソ ー ル を with い て Tay Sachs cells か ら tiny tube を 単 directly from し and GM2 が combining し て い る か ど う か を beg し 検 た. そ の results, ELISA method お よ び ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ method に よ り, 単 from, refined さ れ た tiny tube か ら GM2 が 検 out さ れ た. ま た refined さ れ た チ ュ ー ブ リ ン ダ イ マ ー に タ ク ソ ー ル を plus え て reconstitution し た tiny tubes に, outside か ら GM2 を plus え た と こ ろ and GM2 は tiny tube と combining す る こ と が Ming ら か に な っ た.

项目成果

細谷 浩史: "細胞周期とミオシン軽鎖キナーゼ" Asnual Review細胞生物学. 3. 138-144 (1993)

Hiroshi Hosoya：“细胞周期和肌球蛋白轻链激酶”《细胞生物学年鉴》3. 138-144 (1993)。

M.KOTANI: "Evidence for direct binding of intracellularly distributed ganglioside GM2 to isolated vimentin intermediate filaments in normal and Tay-Sachs disease human fibroblasts" Cell Structure and Function. 18 in press. (1993)

M.KOTANI：“细胞内分布的神经节苷脂 GM2 与正常和泰萨克斯病人类成纤维细胞中分离的波形蛋白中间丝直接结合的证据”细胞结构和功能。

細谷 浩史: "細胞周期とアクチン構造" MEBIO. 10. 41-46 (1993)

Hiroshi Hosoya：“细胞周期和肌动蛋白结构”MEBIO。10. 41-46 (1993)

細谷 浩史: "細胞分裂の利御とミオシン軽鎖キナーゼ" 生化学. 65. 179-183 (1993)

Hiroshi Hosoya：“细胞分裂和肌球蛋白轻链激酶的控制”生物化学 65. 179-183 (1993)。

N.Hosoya: "Localization of caldesmon and its dephosphorylation during cell division" Journal of Cell Biology. 121. 1075-1082 (1993)

N.Hosoya：“细胞分裂过程中钙结合蛋白的定位及其去磷酸化”《细胞生物学杂志》。