シグナル伝達にかかわる蛋白質分子の細胞内における立体構造の3次元再構成

参与信号转导的蛋白质分子细胞内结构的三维重建

• 批准号: 09249204
• 负责人: 片山 栄作
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09249204/
• 关键词: 急速凍結電子顕微鏡法; ディープエッチレプリカ法; イノシトール3燐酸受容体; ライヤノジノ受容体; 3次元再構成; コンピュータ・トモグラフィ; ミオシン・クロスブリッジ; コンフォメーション変化

本研究は、細胞内情報伝達に関与する蛋白質複合体の細胞内における生理的構造および各種の機能状態におけるその構造変化を、高い時間・空間分解能をもつ急速凍結フリーズレプリカ電子顕微鏡法により捉え、新しいアルゴリズムを用いたコンピュータ画像解析によりそれらの3次元像を再構成することを目標として開始した。昨年度までに、細胞内Ca^<2+>-チャネルを形成するライアノジン受容体(RyaR)およびイノシトール3燐酸受容体(IP_3R)の高分解能のレプリカを得ており、これらの試料の像から最終的な3次元像を再構成する予定である。われわれが初めて得た後者の像は、当初の予想よりもはるかに小さく、これまで開発してきた立体視差を利用するアルゴリズムでは精度が不足することが判明した。そこで、レプリカ試料をもっと広範囲の角度に傾斜して像を撮影し、コンピュータ・トモグラフィを用いて対象の3次元像を再構想する方法に切り替えた。一般的には、撮影角度の制限による情報不足のため、このような状況での再構成は困難であるが、レプリカは2次元物体であり、しかも高コントラストの像が得られるために現実に可能となった。当方法の実用性を検証するために、別課題の研究に用いており、X-線結晶解析による高次構造データの得られている骨格筋重メロミオシン(HMM)頭部の構造とそのリガンド結合に伴う構造変化を追ってみた。以前、HMMにATPやADP/バナジン酸を加えると頭部が強く屈曲することを見いだしているが、再構成像では、原子モデルで見られる分子内各ドメインの配置が良く分かり、構造変化の実態がかなり明らかになった。現在、同じ方法を上記の受容体分子の立体構造解析に応用すべく、更なる方法の改良を進めている。既に、クライオ電子顕微鏡法により、平均化した立体構造が提出されているRyaRの3次元像再構成を行い、当方法の信頼性に関する客観的評価を行った後に新たな構造の解析にとりかかる。

This study aims at the structural transformation of intracellular physiological structure and various functional states of protein complexes related to intracellular information transmission, high temporal and spatial decomposition energy, rapid freezing, and reconstruction of three-dimensional images by electron microscopy. In the past year, the formation of intracellular Ca^<2+>-Ca ~(2 +) complex and the high decomposition energy of RyaR and IP_3R were obtained. The final three-dimensional image reconstruction of the sample was determined. The image of the latter was originally intended to be small, and the accuracy of the stereo parallax was insufficient. The angle of inclination of the sample is different from the angle of inclination of the sample, and the method of re-estimating the three-dimensional image of the sample is different. General, capture angle limit, information shortage, this situation, reconstruction difficulties, 2-dimensional objects, high, high, image acquisition, When the method is applied to the study of different subjects, the X-ray crystallographic analysis is used to obtain the high-order structure of the HMM head. In the past, when HMM ATP and ADP/Banna acid were added and the head was strongly flexed, the reconstructed image was formed and the atomic structure was seen. The configuration of each element in the molecule was well separated, and the actual state of structural changes was clear and clear. Now, the same method is used to analyze the three-dimensional structure of the receptor molecule, and the method is improved. In this paper, we propose a new method for reconstruction of three-dimensional images based on electron microscopy and averaging.

项目成果

E.Katayama: "Current Methods in Muscle Physiology : Advantages,Problems and Limitations PP.287-301" Oxford University Press(H.Sugi ed.), 376 (1998)

E.Katayama：“肌肉生理学的当前方法：优点、问题和局限性 PP.287-301”牛津大学出版社（H.Sugi 编辑），376（1998）

片山栄作: "マイカ細片法の応用・急速凍結ディープエッチングレプリカによる分子観察" 電子顕微鏡. 32(3). 166-169 (1997)

Eisaku Katayama：“云母带法的应用/使用速冻深蚀刻复制品的分子观察”电子显微镜32（3）（1997）。

片山 栄作: "細胞膜内におけるべん毛モータの立体構造" 生物物理. 37(2). 63-67 (1997)

Eisaku Katayama：“细胞膜鞭毛运动的三级结构”生物物理学 37(2) (1997)。

E.Katayama: "Quick-Freeze Deep-Etch Electron Macroscopy of the Auto-Heavy Meromyosin during the in vitro Motility Assay" Journal of Molecular Biology. (印刷中).

E. Katayama：“体外运动测定期间自体重肌球蛋白的快速冷冻深蚀刻电子肉眼观察”《分子生物学杂志》（正在出版）。

片山 栄作: "『分子のかたちを見る』:電子顕微鏡による分子観察" 細胞工学. 16(1). 121-130 (1997)

Eisaku Katayama：“‘观察分子的形状’：使用电子显微镜进行分子观察”，Cell Engineering 16(1)。