機能中の蛋白質の動的立体構造解析:新たな電子線3次元画像処理法および標識法の応用

功能蛋白的动态构象分析：新型三维电子束处理和标记方法的应用

基本信息

批准号：
18054007
负责人：
片山栄作
金额：
$ 4.86万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

熱揺動下で確率的に働く蛋白質分子機械の作動原理を探るには機能中の1分子を瞬間的に固定して可視化処理を行い、一切の平均化なしにその挙動と物性を解析するのが理想である。本課題では、個々の分子のサブドメイン構造まで直接観察できる強力な電子顕微鏡法で機能遂行中の超分子複合体の一瞬の姿を捉え、その3次元構造解析のための新技術を駆使して機械の作動機序を原子モデルの動画として示す「1分子の構造生物学」の実現を目指した。筋収縮の分子機構として世界の大部分は、強く屈曲したATP結合型ミオシンのレバーアームがADP解離とともに伸展する際にアクチンの滑りが起きるという「レバーアーム首振り説」を信じる。われわれは高い分解能とコントラストで個々の蛋白質分子の実像を得られる急速凍結フリーズレプリカ法により運動中のアクトミオシンの姿を捉えた。試料表面の凹凸に依る陰影を分子の原子モデルに基づく多数の仮想画像と比較し、当該粒子のコンフォメーションと投影角を精密に識別できる構造差分解析法を擁して解析した結果、運動中の頭部は分子内SH基を化学架橋した分子種に酷似し、従来説のATP結合型とは逆に屈曲していることが判明した。そこでその粒子のレプリカ像を集めて組分け、平均化して立体構造を推定した。さらに、滑り運動中にはその構造が大部分を占め、同じ形状の頭部がアクチン表面を撫でる動きと、その後その構造を保ったまま大きく向きを変えて最終的に硬直複合体に至る伸展運動の2種の動きを行う可能性を示した。後者がADP/Pi放出を伴う張力発生過程で前者は低負荷の際にだけアクチンを変位させる未知の機序と仮定すれば、それらの割合を変えることで観察された全ての画像や従来の実験結果を説明できる。一方で、棒状構造を有する標識を対象蛋白質に付加する手法を開発した。目的の蛋白質への直接融合により対象の特定部位の局在や向きに関する情報が得られる。

探索蛋白质分子机的工作原理，该蛋白质分子机器在热波动下概率地起作用，是立即固定功能分子并执行可视化处理，并分析其行为和物理特性而无需平均而无需平均的理想选择。在该主题中，我们旨在使用强大的电子显微镜捕获功能中超分子复合物的短暂外观，该显微镜可以直接观察单个分子的亚域结构，并实现“一种分子的结构生物学”，该结构生物学使用新技术用于三维结构分析，以显示机械机制作为ATOMIC模型的机制。作为一种肌肉收缩的分子机制，世界上大多数人都相信“杠杆臂摇摆理论”，该理论指出，当强烈弯曲的ATP肌球蛋白的杠杆臂随着ADP解离而扩展时，肌动蛋白会滑落。我们使用快速冻结复制方法捕获了肌动蛋白的运动，该方法允许具有高分辨率和对比度的单个蛋白质分子的真实图像。将样品表面不平衡引起的阴影与基于分子原子模型的许多虚拟图像进行比较，并使用结构差分分析方法进行了分析，该方法允许精确鉴定颗粒的构象和投影角度，并发现运动过程中的头部与具有化学交叉链接的固定式SHS类别和违反的分子相似。然后，收集，分组和平均以估计三维结构。此外，在滑动运动过程中，结构主要占据肌动蛋白的表面，并且可能会发生两种类型的运动：相同形状的头部触及肌动蛋白表面，然后伸展运动，该运动在保留结构的同时急剧变化，同时保留结构，从而导致刚性复合物。假设后者是ADP/PI释放的张力产生的过程，而前者是一种仅在低负载下置换肌动蛋白的未知机制，则更改其比例可以解释所有观察到的图像和常规的实验结果。另一方面，已经开发了一种方法来为靶蛋白添加带有杆状结构的标签。与感兴趣的蛋白质直接融合提供了有关特定目标位点的定位和方向的信息。