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機能中の蛋白質の動的立体構造解析:新たな電子線3次元画像処理法および標識法の応用

功能蛋白的动态构象分析：新型三维电子束处理和标记方法的应用

基本信息

批准号：
18054007
负责人：
片山栄作
金额：
$ 4.86万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

熱揺動下で確率的に働く蛋白質分子機械の作動原理を探るには機能中の1分子を瞬間的に固定して可視化処理を行い、一切の平均化なしにその挙動と物性を解析するのが理想である。本課題では、個々の分子のサブドメイン構造まで直接観察できる強力な電子顕微鏡法で機能遂行中の超分子複合体の一瞬の姿を捉え、その3次元構造解析のための新技術を駆使して機械の作動機序を原子モデルの動画として示す「1分子の構造生物学」の実現を目指した。筋収縮の分子機構として世界の大部分は、強く屈曲したATP結合型ミオシンのレバーアームがADP解離とともに伸展する際にアクチンの滑りが起きるという「レバーアーム首振り説」を信じる。われわれは高い分解能とコントラストで個々の蛋白質分子の実像を得られる急速凍結フリーズレプリカ法により運動中のアクトミオシンの姿を捉えた。試料表面の凹凸に依る陰影を分子の原子モデルに基づく多数の仮想画像と比較し、当該粒子のコンフォメーションと投影角を精密に識別できる構造差分解析法を擁して解析した結果、運動中の頭部は分子内SH基を化学架橋した分子種に酷似し、従来説のATP結合型とは逆に屈曲していることが判明した。そこでその粒子のレプリカ像を集めて組分け、平均化して立体構造を推定した。さらに、滑り運動中にはその構造が大部分を占め、同じ形状の頭部がアクチン表面を撫でる動きと、その後その構造を保ったまま大きく向きを変えて最終的に硬直複合体に至る伸展運動の2種の動きを行う可能性を示した。後者がADP/Pi放出を伴う張力発生過程で前者は低負荷の際にだけアクチンを変位させる未知の機序と仮定すれば、それらの割合を変えることで観察された全ての画像や従来の実験結果を説明できる。一方で、棒状構造を有する標識を対象蛋白質に付加する手法を開発した。目的の蛋白質への直接融合により対象の特定部位の局在や向きに関する情報が得られる。

The accuracy of thermal motion is ideal for the analysis of protein molecular mechanics, for the fixation of molecules, for visualization, for the averaging of all motion and physical properties. This project aims to demonstrate the realization of molecular structural biology by direct observation, powerful electron microscopy, instantaneous detection of supramolecular complexes in functional processes, and animation of three-dimensional structural analysis. Most of the molecular mechanisms of muscle contraction in the world are strongly flexible and ATP-bound. The protein molecules in the protein molecule can be rapidly frozen and the protein molecules in the protein molecule can be rapidly frozen. The surface roughness of the sample depends on the atomic structure of the molecule, and the structure difference analysis method has the ability to accurately identify the projection angle of the particle. The analysis results show that the head in motion resembles the molecular SH group, and the ATP binding type is reversed. The particle size distribution of the particles is estimated based on the composition and average of the particles. The structure of the sliding movement is mostly occupied, the shape of the head is the same, the surface is moved, the structure of the rear is protected, the direction is changed, and the final rigid complex is extended. The possibility of the movement is shown. The latter is accompanied by the tension generation process, the former is the case of low load, the unknown mechanism is determined, the separation is determined, and the results are explained. A square, rod-like structure has been identified and a method of protein addition has been developed. By direct fusion with the protein of interest, information about the location of a specific part of the object in both directions is obtained.