急速凍結レプリカ電子顕微鏡法を駆使した平滑筋収縮のクロスブリッジ構構の研究

速冻复制电镜研究平滑肌收缩的跨桥结构

• 批准号: 09279213
• 负责人: 片山 栄作
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09279213/
• 关键词: 急速凍結電子顕微鏡法; フリーズ・ディープエッチレプリカ法; アクチン; ミオシン・クロースブリッジ; コンフォメーション変化; 3次元再構成; コンピュータートモグラフィ; サブドメイン構造

筆者は、高い空間/時間分解能を有するマイカ細片急速凍結フリーズレプリカ電子顕微鏡法を駆使して、アクチンの滑り運動を起こしているミオシン・クロスブリッジの一瞬の姿を捉え、筋収縮や種々の細胞運動の源となる滑り運動の分子メカニズムを構造の面から追求してきた。これまでに、アクチン・重メロミオシン(HMM)硬直複合体をマイカ表面に吸着させ、そのままで、あるいはATPを加えた直後に急速凍結して得られた像から、硬直複合体においては、HMMの2個の頭部は大部分真っ直ぐ伸びた洋ナシ型の形状をとっており、アクチンの軸方向と約45度の傾きを持って結合していること、また、ATPを加えて滑り運動を開始させると、1HMM分子の2個の頭部は強く折れ曲がり、常にその片側のみで、内側にアクチン・フィラメントを抱くように結合していることなどを示してきた。本年度の研究計画においては、本法を平滑筋アクトミオシン系に応用し、機能遂行中のクロスブリッジの更に詳細な3次元構造を追求することの2点を目標として設定したが、都合により、第2の目標の追求に全力を注ぐこととした。これまでの立体視差を利用する再構成法は精度不足であったので、レプリカ試料を広範囲に傾斜して像を撮影し、コンピュータ・トモグラフィで3次元像再構成する方法に切り替えた。一般的には、撮影角度制限による情報不足のため、このような状況での再構成は困難であるが、レプリカが2次元物体であり、しかも高コントラスト像が得られるために現実に可能となった。当方法の実用性を検証するために、X線結晶解析による高次構造データの得られている骨格筋HMM頭部の構造とそのリガンド結合に伴う構造変化を追ってみた。以前、HMMにATPやADP/バナジン酸を加えると頭部が強く屈曲することを見いだしているが、再構成像では、原子モデルで見られる分子内各ドメインの配置が良く分かり、構造変化の実態がかなり明らかになった。

使用具有高空间/时间分辨率的云母条，我捕获了肌动蛋白正在滑动的肌球蛋白杂交的短暂外观，并追求滑动运动的分子机制，这是肌肉收缩的来源和各种细胞运动的来源。到目前为止，通过在云母表面吸附肌动蛋白丰富的绿色素蛋白（HMM）刚性复合物获得的图像，并在添加ATP后立即迅速冷冻，表明，在刚性复合体中，HMM的两个头部的两个头主要是笔直的，主要是梨形的，并与两种启动的轴向相连，并与45度相连，并在启动时，并与Actin相连。 1HMM分子强烈弯曲，始终仅在分子的一侧结合，以便内部固定肌动蛋白丝。在今年的研究计划中，两个目标是将这种方法应用于平滑肌肌动球蛋白系统，并追求在功能中执行的更详细的三维结构，但是由于便利，我们决定将所有努力付诸实践。以前使用立体规范性的重建方法缺乏准确性，因此我们改用了一种方法，在该方法中，复制品样品在广泛的范围内倾斜并拍摄了成像图像并重建了计算机断层扫描。通常，由于射击角度有限，由于缺乏信息，因此在这种情况下重建是困难的，但是由于复制品是二维对象，并且可以获得高对比度的图像，因此现实中可能是可能的。为了验证这种方法的实用性，我们研究了骨骼肌HMM头的结构，其中通过X射线晶体学获得了高阶结构数据，以及与其配体结合相关的结构变化。以前，我们发现在HMM中添加ATP或ADP/钒酸会强烈弯曲头部，但是重建图像清楚地表明了原子模型中看到的每个分子内域的排列，并且结构上的实际变化已经清楚地阐明了。

项目成果

E.Katayama: "Quick-Frec2e Deep-Etch Electron Microscopy of the Acto Heavy mercmycsin dneing the in vitrc Motili fy Assay" Journal of Molechlar Biology.印刷中

E. Katayama：“Acto Heavy Mercmycsin 的 Quick-Frec2e Deep-Etch Electron Microscopy of the Acto Heavy Mercmycsin dneing the in vitrc Motili fy Assay”《Molechlar Biology》杂志正在出版

片山 栄作: "細胞膜内におけるべん毛モータの立体構造" 生物物理. 37(2). 63-67 (1997)

Eisaku Katayama：“细胞膜鞭毛运动的三级结构”生物物理学 37(2) (1997)。

片山 栄作: "『分子のかたちを見る』:電子顕微鏡による分子観察" 細胞工学. 16(1). 121-130 (1997)

Eisaku Katayama：“‘观察分子的形状’：使用电子显微镜进行分子观察”，Cell Engineering 16(1)。

E.Katayama: "Cuvrent Methods in Mascle Physiology : Adrantages,Problems and Limitations pp.287-301" Oxford University Press (H.Sug : ed.), 376 (1998)

E.Katayama：“肌肉生理学中的当前方法：优点、问题和局限性，第 287-301 页”牛津大学出版社（H.Sug：编辑），376（1998）

片山 栄作: "マイカ細胞法の応用:急速凍結ディープエッチング、レープリカによる分子観察" 電子顕微鏡. 32(3). 166-169 (1997)

Eisaku Katayama：“云母细胞方法的应用：快速冷冻深度蚀刻，使用复制品进行分子观察”电子显微镜32（3）（1997）。