急速凍結フリーズレプリカ法を駆使した細胞内蛋白質の構造ゲノミクス手法の開発と応用

快速冷冻复制法细胞内蛋白结构基因组学方法的开发与应用

基本信息

批准号：
15011212
负责人：
片山栄作
金额：
$ 3.26万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

本課題では、急速凍結電子顕微鏡法を用いて様々な材料に適用できる3次元構造解析法を開発し、溶液中あるいは細胞内において機能遂行中の蛋白質複合体の構造解析に応用することを目標とする。フリーズ・レプリカ試料を対象とする3次元再構成法はほぼ完成し、現在、ネガティブ染色や樹脂包埋切片に対象を拡張すべく改良中である。原子構造が判明している蛋白質を含む試料の場合には、観察されるべきレプリカ像をコンピュータ・シミュレーションにより予測し、それを実際に得られた像と比較して微妙な構造変化を定量的に評価する方法を開発している。実際の材料への応用として、まず、生物分子モーター、アクトミオシン系の機能中の構造を解析した。硬直複合体におけるミオシン頭部は、X線結晶回折のデータから予測されているものとほぼ同等の構造を示したが、滑り運動中には、「レバーアーム首振り」説により予測される分子の屈曲は見られず、むしろ逆方向に曲がるものが大多数であった。そのような構造がADP存在下で2価性試薬により架橋したミオシン頭部の形状に酷似することを見出し、それらの表面の凹凸プロファイルをシミュレーション画像のパターンマッチングにより定量的に比較した。両者は良く一致しており、ミオシン頭部が予想と逆方向に屈曲していることは確実である。他の結果も含め、これまでに観察したすべての構造データを取り込んで、滑り運動の作動機構に関する新たな作業仮説を構築した。現在、それを実験的に検証する手段を検討中である。一方、細胞内構築の表面における特定の分子やそのサブドメインの局在部位をレプリカ試料の視野内で示し、同時に生きた細胞中におけるその分子の動態を蛍光顕微鏡で追うために,高性能の顕微鏡用標識の開発を進めてきた。すでにその分子設計と標識の基本部分の発現は完了している。現在、その先端にさまざまな結合モジュールを融合した蛋白質を作成中である。

该主题旨在开发一种3D结构分析方法，该方法可以使用快速冻结电子显微镜应用于多种材料，并将其应用于在溶液或细胞中功能性执行的蛋白质复合物的结构分析。 Freeze Replica样品的3D重建方法几乎已经完成，目前正在进行改进，以将受试者扩展到负面染色和树脂所包含的部分。对于包含已知原子结构的蛋白质的样品，已经开发了一种方法来预测通过计算机模拟观察的复制图像，并通过将其与实践中获得的图像进行比较来定量评估微妙的结构变化。对于材料中的实际应用，我们首先分析了生物分子运动和肌动蛋白系统的功能结构。刚性复合物中的肌球蛋白头表现出一种结构，该结构大致相当于X射线晶体衍射数据的预测，但是在滑动运动期间，“杠杆臂摇摆”理论预测的分子弯曲理论，大多数肌球蛋白头也没有看到，并且它们的大部分是相反的方向弯曲的。我们发现，这种结构与ADP存在的二价试剂交联的肌球蛋白头的形状与肌球蛋白头的形状相似，并且通过模拟图像的图案匹配，对其表面的不均匀曲线进行了定量比较。两者非常同意，可以肯定的是，肌球蛋白头弯曲的方向与您的期望相反。到目前为止，所有观察到的结构数据，包括其他结果，都纳入了有关滑动运动的致动机理的新工作假设。目前，我们正在考虑通过实验测试这一方法的方法。另一方面，我们一直在开发高性能显微镜标签，以在复制品样品视野内显示特定分子及其子域在细胞内结构表面上的定位位点，同时使用荧光显微镜跟踪活细胞中分子的动力学。标签基本部分的分子设计和表达已经完成。当前，我们正在创建将各种绑定模块融合到尖端的蛋白质。