急速凍結レプリカによる滑り運動中のアクチン結合ミオシン頭部の高分解能構造解析

使用速冻复制品对滑动过程中肌动蛋白结合的肌球蛋白头进行高分辨率结构分析

• 批准号: 11156207
• 负责人: 片山 栄作
• 金额: $ 1.86万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11156207/
• 关键词: 急速凍結電子顕微鏡法; フリーズ・ディープエッヂレプリカ法; アクチン; ミオシン・クロスブリッジ; コンフォメーション変化; 3次元像再構成; サブドメイン構造; シミュレーション法

筆者は、高い空間/時間分解能を有するマイカ細片急速凍結フリーズレプリカ電子顕微鏡法を駆使して、アクチンの滑り運動を起こしているミオシン・クロスブリッジの一瞬の姿を捉え、筋収縮や種々の細胞運動の源となる滑り運動の分子メカニズムを構造の面から追求してきた。既に、マイカ表面に吸着したアクチン・重メロミオシン硬直複合体にATPを添加する前後に急速凍結して得られた像を比較して、クロスブリッジのコンフォメーションに大きな変化があることを発表し、その後は、機能遂行中のクロスブリッジの詳細な3次元像の再構成を目指している。昨年度は、一連の傾斜像を用いたアニメーション表示により、原子モデルで見られるサブドメインの配置が明瞭に認識できることを示したが、今年度は、レプリカ像から3次元再構成するための手法がほぼ完成し、瞬間的に凍結されたいくつかのミオシン頭部粒子の像にそれを適用して、分子の立体構造を解析中である。蛋白質分子内のどの残基がどう配置すれば、電子顕微鏡像として観察された様々なコンフォメーションが実現するかを探るべく、その分野の専門家との共同研究を進めている。また、蛋白質の原子座標のデータを基として、その蛋白質粒子をフリーズレプリカ法で処理した時に観察されるべき像をシミュレーションする方法の開発も並行して進めている。アクチンフィラメントの実際のレプリカ像をシミュレーション像と比較してみた結果、微妙な表面プロファイルまで驚くほど良く一致しており、上記のフリーズレプリカ技術により、恐らく5Aに近い微細構造が識別されているものと推定される。一方で、新たな試料を急速凍結する計画も進行中である。アクチンに負荷をかけた条件におけるクロスブリッジの構造は張力発生の分子機構を探るための重要な情報を提供するであろう。さらに、様々なヌクレオチドを結合した状態でのミオシン頭部の構造の違いの解析も進めている。

The author は, high い space/time decomposition can have す を る マ イ カ fritter quick freezing フ リ ー ズ レ プ リ カ electronic 顕 micro mirror method を 駆 make し て, ア ク チ ン の slide り movement を up こ し て い る ミ オ シ ン · ク ロ ス ブ リ ッ ジ の moment の pose を catch え, jin 収 shrinkage や 々 の cell movement の source と な る slide り movement の molecular メ カ ニ ズ ム を の surface か ら chase Find て て た. に, マ イ に カ surface sorption し た ア ク チ ン, heavy メ ロ ミ オ シ ン hard straight complex に ATP を add す る に before and after quick freezing し て must ら れ た like を compare し て, ク ロ ス ブ リ ッ ジ の コ ン フ ォ メ ー シ ョ ン に big き な variations change が あ る こ と を 発 table し, そ の は, function carries out after の ク ロ ス ブ リ ッ ジ の な three yuan like の again in detail Constitutes を refers to て て る る. Yesterday and annual は for の tilted like を use い た ア ニ メ ー シ ョ ン said に よ り, atomic モ デ ル で see ら れ る サ ブ ド メ イ ン の configuration が clear に で き る こ と を shown し た が, our は, レ プ リ カ like か ら 3 yuan to constitute す る た め の gimmick が ほ ぼ し, instantaneous に freeze さ れ た い く つ か の ミ オ シ ン head の like particles Youdaoplaceholder0 is applicable to て て and を analysis of the three-dimensional structure of molecular <s:1> である. Within the protein molecule の ど の residues が ど う configuration す れ ば, electronic 顕 micro mirror と し て 観 examine さ れ た others 々 な コ ン フ ォ メ ー シ ョ ン が be presently す る か を agent る べ く, そ の eset の 専 door home と の を joint research into め て い る. ま た, protein の atomic coordinates の デ ー タ を base と し て, そ の protein particles を フ リ ー ズ レ プ リ カ method で 処 Richard し た when に 観 examine さ れ る べ き like を シ ミ ュ レ ー シ ョ ン す る method の open 発 も parallel し て in め て い る. ア ク チ ン フ ィ ラ メ ン ト の be interstate の レ プ リ カ like を シ ミ ュ レ ー シ ョ ン like と compare し て み た results, subtle な surface プ ロ フ ァ イ ル ま で surprised く ほ ど good く consistent し て お り, written の フ リ ー ズ レ プ リ カ technology に よ り, fear ら く 5 a に nearly い fine-structure が recognition さ れ て い る も の と presumption さ れ る. One party で, new たな sample を rapid freezing する plan で in progress である. ア ク チ ン に load を か け た conditions に お け る ク ロ ス ブ リ ッ ジ の tension tectonic は 発 raw の molecular institutions を agent る た め の important な intelligence を provide す る で あ ろ う. さ ら に, others 々 な ヌ ク レ オ チ ド を combining し た state で の ミ オ シ ン の head structure の violations い の parsing も into め て い る.

项目成果

Ito, K.: "Cooperativity between two heads of Dictyostelium myosin II in vitro motility and ATP hydrolysis"Biophysical Journal. 76(2). 985-992 (1999)

Ito, K.：“盘基网柄菌肌球蛋白 II 的两个头之间的体外运动和 ATP 水解之间的协同作用”生物物理学杂志。

Sakakibara, H.: "Inner-arm dynein subspecies c of chlomydomonas flagella is a single-headed processive motor with strain sensitivity"Nature. 400(6744). 586-590 (1999)

Sakakibara, H.：“衣藻鞭毛的内臂动力蛋白亚种 c 是具有应变敏感性的单头进行运动”《自然》。

Yamane, K.: "Retinoblastoma susceptibility protein, pRb, possesses multiple BRCT-Ws, BRACA1 carboxyl-terminus-related W regions with DNA break-binging activity"Oncogene. in the press (2000)

Yamane, K.：“视网膜母细胞瘤易感蛋白 pRb 拥有多个 BRCT-W、BRACA1 羧基末端相关 W 区，具有 DNA 断裂结合活性”癌基因。

Konishi, M.: "Structure and enzymatic properties of genetically truncated form of the water insoluble glycan-synthesizing glycotransferase from Strepto coceus subrinus"Journal of Biological Chemistry. 126(2). 287-295 (1999)

Konishi, M.：“来自链球菌 subrinus 的水不溶性聚糖合成糖转移酶的基因截短形式的结构和酶学特性”生物化学杂志。

Tobe, T,: "A novel chronosomal locus of enteropathologenic Escherichig coli (EPEC), which encodes a bfpT-regulated chaperone-like protein, TrcA, involved in microcolony formation by EPEC"Molecular Microbiology. 33(4). 741-752 (1999)

Tobe，T，：“肠病理性大肠杆菌 (EPEC) 的一个新的染色体位点，编码 bfpT 调节的伴侣蛋白 TrcA，参与 EPEC 的微菌落形成”分子微生物学。