作動中の蛋白質複合体の立体構造解析をめざす高精度電子顕微境画像処理法の開発と応用

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急速凍結ディープエッチ・レプリカ電子顕微鏡法を中心として、機能遂行中の個々の蛋白質分子の3次元構造を捉え、その分子構造の変化を高精度で解析することを目標に、その要素技術の開発を続けてきた。今年度は、蛋白質表面の凹凸を反映すると推定されるレプリカ像の表面パターンを対象蛋白質の原子モデルからのシミュレーション像と定量的に比較する構造差分検出法を改良し、それを用いて機能中のアクト重メロミオシン-IIの構造を解析した。その結果、滑り運動中のミオシン頭部ではこれまでに報告のない逆屈曲型のコンフォメーションが実現していることが判明しさらに、同じ構造を取りながらアクチンに対する結合角度のみが変わった粒子も見出したことから、従来説とは大きく異なり、観察されたすべての画像を合理的に説明するクロスブリッジ構造変化の新たなモデルを構築した。一方、長いレバーアームを有し、アクチン上をプロセッシブに歩行中のミオシン-Vのアクチン結合部位の構造について同様の解析を行った。後足は硬直複合体の構造を示し先行研究の結果を支持したが、前足はミオシン-IIの場合と同様、われわれの見出した新たなコンフォメーションを取っていた。これはわれわれの提唱する構造変化の普遍性を如実に示唆するものである。細胞内のさまざまな分子構築中で特定の分子やサブドメインの局在部位と向きをレプリカ試料の視野内で示し、さらに生きた細胞中におけるその分子の動態を蛍光顕微鏡で追うことを可能とする高性能の顕微鏡用標識の開発を進めてきた。そのコンストラクトをミオシンに融合し、ミオシン頭部に目的とする標識を付加させることに成功した。原子間力顕微鏡でその動きの動画記録を試みたが、世界最高性能の機種でも時間/空間分解能が不足し、さらに基板への吸着性が弱く分子全体が不安定であった。将来的には分子内に複数の標識を導入して上記構造モデルを実験的に検証したい。