作動中の蛋白質複合体の立体構造解析をめざす高精度電子顕微境画像処理法の開発と応用

手术中蛋白质复合物三维结构分析高精度电镜图像处理方法的开发与应用

基本信息

批准号：
17053004
负责人：
片山栄作
金额：
$ 2.11万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

急速凍結ディープエッチ・レプリカ電子顕微鏡法を中心として、機能遂行中の個々の蛋白質分子の3次元構造を捉え、その分子構造の変化を高精度で解析することを目標に、その要素技術の開発を続けてきた。今年度は、蛋白質表面の凹凸を反映すると推定されるレプリカ像の表面パターンを対象蛋白質の原子モデルからのシミュレーション像と定量的に比較する構造差分検出法を改良し、それを用いて機能中のアクト重メロミオシン-IIの構造を解析した。その結果、滑り運動中のミオシン頭部ではこれまでに報告のない逆屈曲型のコンフォメーションが実現していることが判明しさらに、同じ構造を取りながらアクチンに対する結合角度のみが変わった粒子も見出したことから、従来説とは大きく異なり、観察されたすべての画像を合理的に説明するクロスブリッジ構造変化の新たなモデルを構築した。一方、長いレバーアームを有し、アクチン上をプロセッシブに歩行中のミオシン-Vのアクチン結合部位の構造について同様の解析を行った。後足は硬直複合体の構造を示し先行研究の結果を支持したが、前足はミオシン-IIの場合と同様、われわれの見出した新たなコンフォメーションを取っていた。これはわれわれの提唱する構造変化の普遍性を如実に示唆するものである。細胞内のさまざまな分子構築中で特定の分子やサブドメインの局在部位と向きをレプリカ試料の視野内で示し、さらに生きた細胞中におけるその分子の動態を蛍光顕微鏡で追うことを可能とする高性能の顕微鏡用標識の開発を進めてきた。そのコンストラクトをミオシンに融合し、ミオシン頭部に目的とする標識を付加させることに成功した。原子間力顕微鏡でその動きの動画記録を試みたが、世界最高性能の機種でも時間/空間分解能が不足し、さらに基板への吸着性が弱く分子全体が不安定であった。将来的には分子内に複数の標識を導入して上記構造モデルを実験的に検証したい。

通过关注快速冷冻深蚀刻复制电子显微镜，我们继续开发这些元素技术，目的是在功能性能过程中捕获单个蛋白质分子的三维结构，并以高精度分析其分子结构的变化。今年，我们改善了结构差异检测方法，该方法在定量上比较了复制图像的表面模式，据估计，这些图像反映了蛋白质表面上的不平衡，并使用来自靶蛋白的原子模型的仿真图像，并使用此方法分析了功能性ACT-Deep-Deep-Deep-Deep-Melomyosin-II的结构。结果，发现在滑动运动过程中，在肌球蛋白头上实现了未报告的构象，并且具有相同结构但仅改变了与肌动蛋白的结合角的粒子，这与常规理论截然不同，与常规桥梁结构变化的新模型合理地解释了所有观察到的图像。另一方面，对肌球蛋白V的肌动蛋白结合位点的结构进行了类似的分析，该结构具有长杆臂，并且正在肌动蛋白上进行处理。后爪表现出刚性复合物的结构，并支持了先前研究的结果，而前爪则采用了我们发现的新构象，就像肌球蛋白-II一样。这清楚地表明了我们提出的结构变化的普遍性。在细胞内的各种分子的构建过程中，我们一直在开发高性能显微镜标签，这些标签显示了在复制品样品视野内的定位位点以及特定分子和子域的取向，并允许生物中分子的动力学在生物中的动力学，并具有荧光显微镜。该结构融合到肌球蛋白上，并成功地将所需的标签添加到了肌球蛋白头上。我们试图使用原子力显微镜记录膜的运动，但即使是世界上最高的性能模型也缺乏时间/空间分辨率，甚至对底物的吸附也很弱，使整个分子变得不稳定。将来，我们希望将多个标签引入分子中，以实验验证上述结构模型。

项目成果

期刊论文数量（6）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

High-performance purification of gelsolin from plasma using anion-exchange porous hollow-fiber membrane.

DOI：
10.1016/j.jchromb.2005.04.031
发表时间：
2005-07
期刊：
Journal of chromatography. B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences
影响因子：
0
作者：
K. Hagiwara;Shinji Yonedu;Kyoichi Saito;Tomoyuki Shiraishi;T. Sugo;Tadashi Tojyo;E. Katayama
通讯作者：
K. Hagiwara;Shinji Yonedu;Kyoichi Saito;Tomoyuki Shiraishi;T. Sugo;Tadashi Tojyo;E. Katayama

Evidence against essential roles for subdomain 1 of actin in actomyosin sliding movements.

肌动蛋白亚结构域 1 在肌动球蛋白滑动运动中重要作用的证据。