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急速凍結フリーズレプリカ法を駆使した細胞内蛋白質の構造ゲノミクス手法の開発と応用

快速冷冻复制法细胞内蛋白结构基因组学方法的开发与应用

基本信息

批准号：
16011215
负责人：
片山栄作
金额：
$ 3.58万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

急速凍結ディープエッチ・レプリカ電子顕微鏡法を中心として、細胞内で機能遂行中の個々の蛋白質分子の3次元構造を一挙に捉え、その分子構造の変化を高精度で解析することを最終目標に据え、その基盤となる3種類の要素技術の開発を続けてきた。1)先ず、急速凍結レプリカ像から蛋白質1分子の3次元構造を再構成法する手法は概ね完成し、今年度はネガティブ染色試料やあるいは樹脂包埋切片など奥行きを持つ構造物のトモグラフィ手法の開発に着手した。新たな着想に基づき、電子線トモグラフィの最大の問題点である高さ方向の分解能劣化を最小限度に抑えて、アクトミオシンのネガティブ染色試料から一切の平均化なしでその3次元像を再構成することに成功した。また、高さ方向の分解能を更に向上させるための効果的な画像修復法を検討した。2)蛋白質表面の凹凸を反映すると推定されるレプリカ像の表面パターンを対象蛋白質の原子モデルからのシミュレーション像と定量的に比較する手法を開発した。それを用いて、機能中に急速凍結固定したアクト重メロミオシンの構造を解析した結果、滑り運動中のミオシン頭部ではこれまでに報告のない新たなコンフォメーションが実現していることが判明した。またクロスブリッジの構造変化の順序を合理的に推定することができた。3)細胞内に存在するさまざまの分子構築において、特定の分子やサブドメインの局在部位と向きをレプリカ試料の視野内で示し、さらには生きた細胞中におけるその分子の動態を蛍光顕微鏡で追うことを可能とする高性能の顕微鏡用標識の開発を進めてきた。上記のクロスブリッジの構造変化を直接の動画像として捉えるため、新たなデザインに基づくコンストラクトをミオシンに融合し、ミオシン頭部に目的とする標識を付加させることに成功した。さらに、生きた細胞内の受容体蛋白質など、より広範囲の分子構築にも同手法を適用すべく同様の試みを開始した。

The rapid development of the computer microanalysis center and the ability of the intracellular machine to realize the three-dimensional generation of the two protein molecules in the center, and the high-precision analysis of the key technologies such as the most important data and the basic basic technology. 1) in the first place and in a rapid way, the protein 1 molecule has been created in three dimensions and then the method has been almost completed. this year, the dyeing material has been stained, and the fat-embedded section has been successfully sectioned. This year, the creation system has been successfully developed. The new system is based on the principle, the maximum problem point of the cable system, the maximum problem point, the high temperature direction decomposition, which can deteriorate the minimum pressure, and the dyeing material will be reduced to an average of three dimensions. The decomposition of the direction of height and height can further improve the effect of the method of portrait modification. 2) the concavity and convexity of the protein surface reflects the presumption that the protein surface is similar to that of the protein, which is similar to that of the protein. In the middle of the operation, the results of the analysis of the results and the results of the analysis of the results of the analysis of the results of the monitoring and analysis of the results, and the report of the emergency report of the department of health in the middle of the operation, were used to analyze the results of the monitoring and analysis of the results. There is a reasonable presumption that the order is reasonable. 3) there is a significant increase in the number of molecules in the cell, and the location of the specific molecule is displayed in the field of the material. In the cell of the cell, it is possible to use a high-performance indicator to improve the performance of the system. The last part of the system is used to make a picture of the image directly, the new one is the key, the image is integrated, and the purpose of the department is to recognize the identity and the success of the image. In the same way, the intracellular capacitive proteins and molecules of crude and crude oils were used in the same way as each other.