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急速凍結フリーズレプリカ法を駆使した細胞内蛋白質の構造ゲノミクス手法の開発と応用

快速冷冻复制法细胞内蛋白结构基因组学方法的开发与应用

基本信息

批准号：
14011210
负责人：
片山栄作
金额：
$ 3.65万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14011210/
关键词：
急速凍結

项目摘要

われわれは、急速凍結フリーズ・レプリカ電子顕微鏡の特長を利用して、溶液内あるいは細胞内で機能遂行中の1個1個の蛋白質の一瞬の姿を捉え、その立体構造を精密に解析する一連の手法の開発と応用を進めている。具体的方法として、レプリカ像からの3次元再構成、そして原子構造既知の蛋白質やその複合体に想定されるレプリカ像のコンピュータ・シミュレーションを行ってきた。本年度は、in vitro滑り運動中のウサギ・アクトミオシン複合体試料中でしばしば観察され、アクチンフィラメントを抱き込む形で結合するミオシン頭部の構造解析を行った。ミオシン頭部はATP結合により強く屈曲することが知られ、そのX線結晶構造が発表されている。またミオシンATPaseのさまざまな反応中間体アナログを形成する金属イオン/ADP複合体でも類似の構造を取ると考えられている。しかし、これらの構造から予測されるシミュレーション画像は上記のアクチン結合ミオシンの画像とは合致しなかった。そこで、不安定な中間状態において2価性試薬(pPDM)で化学架橋を施したミオシン頭部のレプリカ画像を捉え、その3次元構造を解析したところ、滑り運動中のアクチン結合ミオシンの画像と酷似することが判明した。その構造は上記の結晶構造のレバーアーム部分をほぼ逆方向に回転させることにより得られるものであった。一方、pPDMで架橋したホタテ貝ミオシン頭部のX線結晶構造がごく最近発表され、ADP結合ミオシンに近いと結論されているが、その構造はわれわれが見出したものとは全く異なる。ウサギ・ミオシンではpPDMによる架橋はSH-1、SH-2と称される2個のチオール基をつなぐが、ホタテ貝ミオシンではSH-2とリジンが架橋されることが分かっている、これらのことから種の異なるミオシンの架橋産物が別の構造を取っているものと考えれば説明可能であろう。軽鎖中のSH基に入れた蛍光標識のスペクトルの特徴も同様のことを示唆している。

The advantages of electron microscopes are utilized in solution, intracellular function, instantaneous detection of protein structure, precise analysis of three-dimensional structure, and continuous development of methods. The specific method is to reconstruct the three-dimensional structure of the image, to reconstruct the protein complex with the known atomic structure, and to design the three-dimensional structure of the image. This year, the structural analysis of the head of the composite sample in the vitro sliding movement was carried out. The X-ray crystallographic structure of the head of the film was developed by ATP binding and strong buckling. A study on the formation of metal/ADP complexes and similar structures for the enzyme The structure of the film is expected to be measured in the future. The chemical bridge is applied to the image of the head, and the three-dimensional structure is analyzed to determine the similarity between the image of the head and the image of the sliding motion. The structure of the crystal structure is reversed. The X-ray crystallographic structure of the head of a square, pPDM, bridge, ADP, bridge, bridge, The bridge between SH-1 and SH-2 is divided into two parts: SH-2 and SH-1. The bridge between SH-2 and SH-1 is divided into two parts: SH-1 and SH-2. The bridge between SH-1 and SH-2 is divided into two parts: SH-1 and SH-2. The bridge between SH-1 and SH-2 is divided into two parts: SH-1 and SH-2. The bridge between SH-1 and SH-2 is divided into two parts: SH-1 and SH-2. The bridge between SH-1 and SH-2 is divided into two parts: SH-1 and SH-2 is divided into three parts: SH-1 and SH-2 is divided into three parts: SH-2 and SH-2 is divided into three parts: SH-1 and SH-2 is divided into three parts: SH-2 is divided into three parts: SH-2 and SH-2 is divided into three parts: SH The SH group in the lock is inserted into the light mark, and the characteristics of the lock are displayed in the same way.