急速凍結フリーズレプリカ法を駆使した細胞内蛋白質の構造ゲノミクス手法の開発と応用

快速冷冻复制法细胞内蛋白结构基因组学方法的开发与应用

• 批准号: 14011210
• 负责人: 片山 栄作
• 金额: $ 3.65万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14011210/
• 关键词: 急速凍結

われわれは、急速凍結フリーズ・レプリカ電子顕微鏡の特長を利用して、溶液内あるいは細胞内で機能遂行中の1個1個の蛋白質の一瞬の姿を捉え、その立体構造を精密に解析する一連の手法の開発と応用を進めている。具体的方法として、レプリカ像からの3次元再構成、そして原子構造既知の蛋白質やその複合体に想定されるレプリカ像のコンピュータ・シミュレーションを行ってきた。本年度は、in vitro滑り運動中のウサギ・アクトミオシン複合体試料中でしばしば観察され、アクチンフィラメントを抱き込む形で結合するミオシン頭部の構造解析を行った。ミオシン頭部はATP結合により強く屈曲することが知られ、そのX線結晶構造が発表されている。またミオシンATPaseのさまざまな反応中間体アナログを形成する金属イオン/ADP複合体でも類似の構造を取ると考えられている。しかし、これらの構造から予測されるシミュレーション画像は上記のアクチン結合ミオシンの画像とは合致しなかった。そこで、不安定な中間状態において2価性試薬(pPDM)で化学架橋を施したミオシン頭部のレプリカ画像を捉え、その3次元構造を解析したところ、滑り運動中のアクチン結合ミオシンの画像と酷似することが判明した。その構造は上記の結晶構造のレバーアーム部分をほぼ逆方向に回転させることにより得られるものであった。一方、pPDMで架橋したホタテ貝ミオシン頭部のX線結晶構造がごく最近発表され、ADP結合ミオシンに近いと結論されているが、その構造はわれわれが見出したものとは全く異なる。ウサギ・ミオシンではpPDMによる架橋はSH-1、SH-2と称される2個のチオール基をつなぐが、ホタテ貝ミオシンではSH-2とリジンが架橋されることが分かっている、これらのことから種の異なるミオシンの架橋産物が別の構造を取っているものと考えれば説明可能であろう。軽鎖中のSH基に入れた蛍光標識のスペクトルの特徴も同様のことを示唆している。

わ れ わ れ は, rapid freezing フ リ ー ズ · レ プ リ カ electronic 顕 micromirror の specialty を using し て, solution あ る い は で function in the cell carries out the の 1 1 の protein の moment の pose を catch え, そ の three-dimensional structure を precision analytical す に る の technique in a row の open 発 と 応 を into め て い る. Specific methods と し て, レ プ リ カ like か ら の three yuan structure, again そ し て atomic structure both know の protein や そ の complex に scenarios さ れ る レ プ リ カ like の コ ン ピ ュ ー タ · シ ミ ュ レ ー シ ョ ン を line っ て き た. は this year, in vitro sliding motion of り の ウ サ ギ · ア ク ト ミ オ シ ン complex sample in で し ば し ば 観 examine さ れ, ア ク チ ン フ ィ ラ メ ン ト を embrace き 込 で む form combining す る ミ オ シ ン の head structure line を っ た. ミ オ シ ン head は ATP combining に よ り strong く buckling す る こ と が know ら れ, そ の X-ray crystal structure が 発 table さ れ て い る. ま た ミ オ シ ン ATPase の さ ま ざ ま な anti 応 intermediates ア ナ ロ グ を form す る metal イ オ ン / ADP complex で も similar の tectonic を take る と exam え ら れ て い る. し か し, こ れ ら の tectonic か ら be さ れ る シ ミ ュ レ ー シ ョ ン portrait は written の ア ク チ ン combining ミ オ シ ン の portrait と は close to し な か っ た. そ こ で, state of unrest among な に お い て 2 価 sex try 薬 (pPDM) で chemical bridging を shi し た ミ オ シ ン head の レ プ リ カ portrait を catch え, そ の 3 dimensional structure analytical し を た と こ ろ, smooth り movement の ア ク チ ン combining ミ オ シ ン の portrait と resembles す る こ と が.at し た. そ の tectonic は written の crystal structure の レ バ ー ア ー ム part を ほ ぼ に back in reverse planning さ せ る こ と に よ り must ら れ る も の で あ っ た. Bridge side, pPDM で し た ホ タ テ bei ミ オ シ ン head の X-ray crystal structure が ご く recently 発 table さ れ, ADP ミ オ シ ン に nearly い と conclusion さ れ て い る が, そ の tectonic は わ れ わ れ が shows し た も の と は く all different な る. ウ サ ギ · ミ オ シ ン で は pPDM に よ る bridging は SH - 1, 2 と SH - said さ れ る 2 の チ オ ー ル base を つ な ぐ が, ホ タ テ bei ミ オ シ ン で は SH - 2 と リ ジ ン が bridging さ れ る こ と が points か っ て い る, こ れ ら の こ と か ら kind の different な る ミ オ シ ン の bridge product が don't の tectonic を take っ て い る も の と え test Youdaoplaceholder0 indicates possibly であろう. In a 軽 lock, the <s:1> SH base に is filled with れた蛍 light to identify the <s:1> スペ ト ト <s:1> feature <s:1> similar to the <s:1> とを とを indicating the て て る る る.

项目成果

H.Tanaka: "The motor domain, not a long neck domain, determines the large step of myosin-V"Nature. 415. 192-195 (2002)

H.Tanaka：“运动域，而不是长颈域，决定了肌球蛋白-V 的大步长”性质。

M.Fukuda: "The calcium-binding loops of the tandem C2 domains of synaptotagmin VII cooperatively mediate calcium-dependent oligomerization"Journal of Biological Chemistry. 277. 29315-29320 (2002)

M.Fukuda：“突触结合蛋白 VII 串联 C2 结构域的钙结合环协同介导钙依赖性寡聚化”生物化学杂志。

K.Tamano: "Shigella Spa32 is an essential secretory protein for functional type III secretion machinery and uniformity of its needle length"Journal of Bacteriology. 184. 1244-1252 (2002)

K.Tamano：“志贺氏菌 Spa32 是一种重要的分泌蛋白，对于 III 型分泌机制的功能及其针长度的一致性至关重要”《细菌学杂志》。

M.Tominaga: "Oiwa Higher plant myosin XI moves processively on actin with 35 nm steps at high velocity"EMBO Journal. (印刷中). (2003)

M.Tominaga：“Oiwa 高等植物肌球蛋白 XI 以 35 nm 的速度在肌动蛋白上持续移动”EMBO 杂志（2003 年出版）。

S.Nishikawa: "Class VI myosin moves processively along actin filaments backward with large steps"Biochemical and Biophysical Research Communications. 290. 311-317 (2002)

S.Nishikawa：“VI 类肌球蛋白沿着肌动蛋白丝大步向后移动”《生物化学和生物物理研究通讯》。