急速凍結フリーズレプリカ法を駆使した細胞内蛋白質の構造ゲノミクス手法の開発と応用

快速冷冻复制法细胞内蛋白结构基因组学方法的开发与应用

基本信息

批准号：
14011210
负责人：
片山栄作
金额：
$ 3.65万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14011210/
关键词：
急速凍結

项目摘要

われわれは、急速凍結フリーズ・レプリカ電子顕微鏡の特長を利用して、溶液内あるいは細胞内で機能遂行中の1個1個の蛋白質の一瞬の姿を捉え、その立体構造を精密に解析する一連の手法の開発と応用を進めている。具体的方法として、レプリカ像からの3次元再構成、そして原子構造既知の蛋白質やその複合体に想定されるレプリカ像のコンピュータ・シミュレーションを行ってきた。本年度は、in vitro滑り運動中のウサギ・アクトミオシン複合体試料中でしばしば観察され、アクチンフィラメントを抱き込む形で結合するミオシン頭部の構造解析を行った。ミオシン頭部はATP結合により強く屈曲することが知られ、そのX線結晶構造が発表されている。またミオシンATPaseのさまざまな反応中間体アナログを形成する金属イオン/ADP複合体でも類似の構造を取ると考えられている。しかし、これらの構造から予測されるシミュレーション画像は上記のアクチン結合ミオシンの画像とは合致しなかった。そこで、不安定な中間状態において2価性試薬(pPDM)で化学架橋を施したミオシン頭部のレプリカ画像を捉え、その3次元構造を解析したところ、滑り運動中のアクチン結合ミオシンの画像と酷似することが判明した。その構造は上記の結晶構造のレバーアーム部分をほぼ逆方向に回転させることにより得られるものであった。一方、pPDMで架橋したホタテ貝ミオシン頭部のX線結晶構造がごく最近発表され、ADP結合ミオシンに近いと結論されているが、その構造はわれわれが見出したものとは全く異なる。ウサギ・ミオシンではpPDMによる架橋はSH-1、SH-2と称される2個のチオール基をつなぐが、ホタテ貝ミオシンではSH-2とリジンが架橋されることが分かっている、これらのことから種の異なるミオシンの架橋産物が別の構造を取っているものと考えれば説明可能であろう。軽鎖中のSH基に入れた蛍光標識のスペクトルの特徴も同様のことを示唆している。

我们正在开发和应用一系列方法，这些方法利用快速冻结复制品电子显微镜的特征来捕获溶液或细胞中每种蛋白质的瞬时外观，并精确分析其三维结构。具体方法包括复制图像的三维重建以及用于已知的原子结构和复合物假定的复制图像的计算机模拟。今年，我们对肌球蛋白头进行了结构分析，在体外滑动运动过程中通常会在兔肌动蛋白复合物样品中观察到，并以包含肌动蛋白丝的方式结合。众所周知，ATP键强烈弯曲肌球蛋白头，其X射线晶体结构已宣布。还认为形成肌球蛋白ATPase的各种反应中间类似物的金属离子/ADP复合物将采用相似的结构。但是，这些结构预测的仿真图像与上述肌动蛋白结合的肌球蛋白的图像不匹配。因此，在不稳定的中间状态下，捕获了与二价试剂（PPDM）化学交联的肌球蛋白头的复制图像，并分析了三维结构，并且发现它与滑动运动过程中肌动蛋白结合的肌球蛋白的图像非常相似。通过将上述晶体结构的杆臂部分沿基本相反的方向旋转，从而获得了这种结构。同时，最近出版了由PPDM交联的扇贝肌球蛋白头的X射线晶体结构，并得出结论，它接近ADP结合的肌球蛋白，但其结构与我们发现的结构完全不同。在兔肌球蛋白中，PPDM交联的两个称为SH-1和SH-2的硫醇组，但在扇贝肌球蛋白中，众所周知，SH-2和赖氨酸是交联的，可以通过考虑不同种类肌球蛋白的交联产物可以解释。放置在光链中SH组中的荧光标签的光谱特性表明相同。