急速凍結フリーズレプリカ法を駆使した細胞内蛋白質の構造ゲノミクス手法の開発と応用

快速冷冻复制法细胞内蛋白结构基因组学方法的开发与应用

基本信息

  • 批准号:
    14011210
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 3.65万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
  • 财政年份:
    2002
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    2002 至 无数据
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

われわれは、急速凍結フリーズ・レプリカ電子顕微鏡の特長を利用して、溶液内あるいは細胞内で機能遂行中の1個1個の蛋白質の一瞬の姿を捉え、その立体構造を精密に解析する一連の手法の開発と応用を進めている。具体的方法として、レプリカ像からの3次元再構成、そして原子構造既知の蛋白質やその複合体に想定されるレプリカ像のコンピュータ・シミュレーションを行ってきた。本年度は、in vitro滑り運動中のウサギ・アクトミオシン複合体試料中でしばしば観察され、アクチンフィラメントを抱き込む形で結合するミオシン頭部の構造解析を行った。ミオシン頭部はATP結合により強く屈曲することが知られ、そのX線結晶構造が発表されている。またミオシンATPaseのさまざまな反応中間体アナログを形成する金属イオン/ADP複合体でも類似の構造を取ると考えられている。しかし、これらの構造から予測されるシミュレーション画像は上記のアクチン結合ミオシンの画像とは合致しなかった。そこで、不安定な中間状態において2価性試薬(pPDM)で化学架橋を施したミオシン頭部のレプリカ画像を捉え、その3次元構造を解析したところ、滑り運動中のアクチン結合ミオシンの画像と酷似することが判明した。その構造は上記の結晶構造のレバーアーム部分をほぼ逆方向に回転させることにより得られるものであった。一方、pPDMで架橋したホタテ貝ミオシン頭部のX線結晶構造がごく最近発表され、ADP結合ミオシンに近いと結論されているが、その構造はわれわれが見出したものとは全く異なる。ウサギ・ミオシンではpPDMによる架橋はSH-1、SH-2と称される2個のチオール基をつなぐが、ホタテ貝ミオシンではSH-2とリジンが架橋されることが分かっている、これらのことから種の異なるミオシンの架橋産物が別の構造を取っているものと考えれば説明可能であろう。軽鎖中のSH基に入れた蛍光標識のスペクトルの特徴も同様のことを示唆している。
わ れ わ れ は, rapid freezing フ リ ー ズ · レ プ リ カ electronic 顕 micromirror の specialty を using し て, solution あ る い は で function in the cell carries out the の 1 1 の protein の moment の pose を catch え, そ の three-dimensional structure を precision analytical す に る の technique in a row の open 発 と 応 を into め て い る. Specific methods と し て, レ プ リ カ like か ら の three yuan structure, again そ し て atomic structure both know の protein や そ の complex に scenarios さ れ る レ プ リ カ like の コ ン ピ ュ ー タ · シ ミ ュ レ ー シ ョ ン を line っ て き た. は this year, in vitro sliding motion of り の ウ サ ギ · ア ク ト ミ オ シ ン complex sample in で し ば し ば 観 examine さ れ, ア ク チ ン フ ィ ラ メ ン ト を embrace き 込 で む form combining す る ミ オ シ ン の head structure line を っ た. ミ オ シ ン head は ATP combining に よ り strong く buckling す る こ と が know ら れ, そ の X-ray crystal structure が 発 table さ れ て い る. ま た ミ オ シ ン ATPase の さ ま ざ ま な anti 応 intermediates ア ナ ロ グ を form す る metal イ オ ン / ADP complex で も similar の tectonic を take る と exam え ら れ て い る. し か し, こ れ ら の tectonic か ら be さ れ る シ ミ ュ レ ー シ ョ ン portrait は written の ア ク チ ン combining ミ オ シ ン の portrait と は close to し な か っ た. そ こ で, state of unrest among な に お い て 2 価 sex try 薬 (pPDM) で chemical bridging を shi し た ミ オ シ ン head の レ プ リ カ portrait を catch え, そ の 3 dimensional structure analytical し を た と こ ろ, smooth り movement の ア ク チ ン combining ミ オ シ ン の portrait と resembles す る こ と が.at し た. そ の tectonic は written の crystal structure の レ バ ー ア ー ム part を ほ ぼ に back in reverse planning さ せ る こ と に よ り must ら れ る も の で あ っ た. Bridge side, pPDM で し た ホ タ テ bei ミ オ シ ン head の X-ray crystal structure が ご く recently 発 table さ れ, ADP ミ オ シ ン に nearly い と conclusion さ れ て い る が, そ の tectonic は わ れ わ れ が shows し た も の と は く all different な る. ウ サ ギ · ミ オ シ ン で は pPDM に よ る bridging は SH - 1, 2 と SH - said さ れ る 2 の チ オ ー ル base を つ な ぐ が, ホ タ テ bei ミ オ シ ン で は SH - 2 と リ ジ ン が bridging さ れ る こ と が points か っ て い る, こ れ ら の こ と か ら kind の different な る ミ オ シ ン の bridge product が don't の tectonic を take っ て い る も の と え test Youdaoplaceholder0 indicates possibly であろう. In a 軽 lock, the <s:1> SH base に is filled with れた蛍 light to identify the <s:1> スペ ト ト <s:1> feature <s:1> similar to the <s:1> とを とを indicating the て て る る る.

项目成果

期刊论文数量(12)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
H.Tanaka: "The motor domain, not a long neck domain, determines the large step of myosin-V"Nature. 415. 192-195 (2002)
H.Tanaka:“运动域,而不是长颈域,决定了肌球蛋白-V 的大步长”性质。
  • DOI:
  • 发表时间:
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
M.Fukuda: "The calcium-binding loops of the tandem C2 domains of synaptotagmin VII cooperatively mediate calcium-dependent oligomerization"Journal of Biological Chemistry. 277. 29315-29320 (2002)
M.Fukuda:“突触结合蛋白 VII 串联 C2 结构域的钙结合环协同介导钙依赖性寡聚化”生物化学杂志。
  • DOI:
  • 发表时间:
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
K.Tamano: "Shigella Spa32 is an essential secretory protein for functional type III secretion machinery and uniformity of its needle length"Journal of Bacteriology. 184. 1244-1252 (2002)
K.Tamano:“志贺氏菌 Spa32 是一种重要的分泌蛋白,对于 III 型分泌机制的功能及其针长度的一致性至关重要”《细菌学杂志》。
  • DOI:
  • 发表时间:
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
M.Tominaga: "Oiwa Higher plant myosin XI moves processively on actin with 35 nm steps at high velocity"EMBO Journal. (印刷中). (2003)
M.Tominaga:“Oiwa 高等植物肌球蛋白 XI 以 35 nm 的速度在肌动蛋白上持续移动”EMBO 杂志(2003 年出版)。
  • DOI:
  • 发表时间:
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
S.Nishikawa: "Class VI myosin moves processively along actin filaments backward with large steps"Biochemical and Biophysical Research Communications. 290. 311-317 (2002)
S.Nishikawa:“VI 类肌球蛋白沿着肌动蛋白丝大步向后移动”《生物化学和生物物理研究通讯》。
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  • 发表时间:
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
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  • 通讯作者:
    片山 栄作
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肌平与 acto-S1 嵌合蛋白细丝的相互作用。
  • DOI:
  • 发表时间:
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  • 期刊:
  • 影响因子:
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  • 作者:
    和沢 鉄一;シディック;宮崎 崇;片山 栄作;上田 太郎;鈴木 誠
  • 通讯作者:
    鈴木 誠
急速凍結ディープエッチ・レプリカ法:その特長と最近の企てについて
快速冷冻深蚀刻复制方法:其特点和近期尝试
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    2004
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    片山 栄作

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    11156207
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急速凍結レプリカ電子顕微鏡法を駆使した平滑筋収縮のクロスブリッジ構構の研究
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    09279213
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    1997
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车载中央计算平台软件框架及泊车功能研发与产业化应用
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相似海外基金

Connectmics analysis of functional synapses by microwave rapid freezing method
微波快速冷冻法对功能突触的连接组学分析
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    17K08525
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Rapid freezing quench and ESR studies of biological molecules in transient states
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    17K05758
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    2017
  • 资助金额:
    $ 3.65万
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    Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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    1515297
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    2015
  • 资助金额:
    $ 3.65万
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    Fellowship Award
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  • 批准号:
    25610118
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    2013
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急速凍結免疫エッチングレプリカ法による細胞膜裏打ち細胞骨格の制御機構解析
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  • 批准号:
    06J06371
  • 财政年份:
    2006
  • 资助金额:
    $ 3.65万
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for JSPS Fellows
急速凍結フリーズレプリカ法を駆使した細胞内蛋白質の構造ゲノミクス手法の開発と応用
快速冷冻复制法细胞内蛋白结构基因组学方法的开发与应用
  • 批准号:
    16011215
  • 财政年份:
    2004
  • 资助金额:
    $ 3.65万
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
急速凍結フリーズレプリカ法を駆使した細胞内蛋白質の構造ゲノミクス手法の開発と応用
快速冷冻复制法细胞内蛋白结构基因组学方法的开发与应用
  • 批准号:
    15011212
  • 财政年份:
    2003
  • 资助金额:
    $ 3.65万
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
高圧急速凍結装置を用いたショウジョウバエ胚の凍結保存法に関する技術
高压速冻装置果蝇胚胎冷冻保存技术
  • 批准号:
    15918021
  • 财政年份:
    2003
  • 资助金额:
    $ 3.65万
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    Grant-in-Aid for Encouragement of Scientists
急速凍結分光法を使った金属酵素およびセンサー蛋白質の反応機構の研究
利用快速冷冻光谱研究金属酶和传感器蛋白的反应机制
  • 批准号:
    15657027
  • 财政年份:
    2003
  • 资助金额:
    $ 3.65万
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Exploratory Research
脂質性ドメイン解析のための急速凍結・免疫電顕法の開発
用于脂质结构域分析的快速冷冻和免疫电子显微镜的开发
  • 批准号:
    13877003
  • 财政年份:
    2001
  • 资助金额:
    $ 3.65万
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Exploratory Research
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知道了