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DNA修復遺伝子欠損マウスを用いた中枢ニューロン死分子機構の解析

DNA修复基因缺陷小鼠分析中枢神经元死亡的分子机制

基本信息

批准号：
09269213
负责人：
畠中寛
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09269213/
关键词：
アポトーシス p53 スライス培養小脳 DNA鎖切断 c-Jun TUNEL染色神経変性疾患

项目摘要

脳神経系におけるニューロンのアポトーシスは、非分裂細胞にとって、その死が置き換えがきかないことも重要なものと考えられている。特に、疾患あるいは障害によって生じるアポトーシスは、脳神経系における機能に重大な影響を及ぼすものと考えられる。私達は分散培養した小脳顆粒細胞を用いてDNA鎖切断傷害で生じるアポトーシスに、がん抑制遺伝子p53が関わっていることを明らかにしてきた。今年度は脳神経系を構成している様々な細胞相互の影響がどのようにニューロン死に関わっているのか明らかにする目的で、よりin vivoに近い系である切片培養系を用い、さらに研究を進めた。生後12日目の野生型またはp53ノックアウトマウスの小脳を、正中線に平行に厚さ400μmにスライスし、多孔質膜上で1日間培養後、DNA鎖切断をもたらす薬剤ブレオマイシンを添加し、切片培養下のニューロンに与える影響を調べた。培養後凍結切片を作製し、ニッスルおよびTUNEL染色、さらに抗p53および抗c-Jun抗体での免疫組織化学染色を行った。その結果、野生型マウスの小脳を用いた培養切片組織ではブレオマイシン添加により、経時的なTUNEL陽性細胞の増加を観察した。同時に、p53およびc-Jun陽性細胞の増加がみられた。既に、我々は野生型マウス小脳顆粒細胞の分散培養系で、ブレオマイシンを加えたときにc-Junの発現上昇がみられることをウエスタンブロティングで明らかにしている。この発現上昇はp53ノックアウトマウスからの顆粒細胞では見られなかった。切片培養下でも野生型マウスの小脳切片組織上の内顆粒層では、ブレオマイシン添加により、p53およびc-Jun陽性細胞の増加がみられた。分散培養系と同様切片培養系でも、p53ノックアウトマウスのものではc-Jun陽性細胞の増加は見られなかった。この結果は、c-Junの発現上昇が、分散培養系のみならず切片培養系でも確認されたことを示している。これらのことから、DNA切断に伴うアポトーシスはp53に依存しておこり、c-Junの発現の上昇が、何らかの形で関与していることを強く示唆している。

In the case of the nervous system, the number of cells in the brain is not equal to that of the non-dividing cells. Special diseases, such as diabetes, etc. The DNA lock was used to cut off the damage and inhibit the gene p53. This year, the effects of cell interaction on the composition of the nervous system were studied in vivo. 12 days after birth, wild-type DNA fragments were isolated from p53, 400μm thick, and porous plasma membranes. After day culture, DNA fragments were isolated from the cells and the effects of DNA fragments were modulated. After culture, frozen sections were prepared, TUNEL staining, and immunohistochemical staining with anti-p53 and anti-c-Jun antibodies. The results showed that the wild-type cells were increased by adding TUNEL positive cells to the culture sections. At the same time, p53 and c-Jun positive cells increased. In addition, the expression of c-Jun in the wild type granulosa cells was increased. The expression of these cells rises to p53. In vitro culture, there was an increase of p53-and c-Jun-positive cells in the inner granular layer of the wild-type cells. Dispersion culture system and the same section culture system are used to increase the number of c-Jun positive cells The results showed that the expression of c-Jun increased, and the expression of c-Jun in the culture system was confirmed. DNA fragmentation is associated with p53 dependency, c-Jun occurrence, and the formation of DNA fragmentation.