遺伝子工学を応用した硝化脱窒過程の解析と高効率化

利用基因工程分析硝化反硝化过程并提高效率

• 批准号: 03202222
• 负责人: 飯島 信司
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1991
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1991 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-03202222/
• 关键词: 亜硝酸還元酵素; 脱窒過程; 廃水処理; クロ-ニング; 遺伝子工学; 硝化過程; 好気的処理

遺伝子工学を応用して窒素除去を好気的な硝化過程と嫌気的な脱窒過程を同時に行うことを目指して、亜硝酸還元酵素の遺伝子のクロ-ン化を試みている。前年度までにP.denitrificans由来の亜硝酸還元酵素を精製後、亜硝酸還元酵素遺伝子を含むDNA断片をクロ-ン化したが、N末端アミノ酸配列部位およびプロモ-タ-を含む5'ーflanking領域が欠失していた。本年度は、亜硝酸還元遺伝子全体をクロ-ン化して活性のある亜硝酸還元酵素を得るとともに、遺伝子があると期待される他の脱窒に必要な酵素遺伝子をクロ-ン化することを試みた。P.denitrificansの染色体DNAをXhoIで完全消化およびSa1Iで部分消化しλファ-ジを用いたXhoI、Sa1Iライブラリ-を作成し、クロ-ン化された遺伝子の隣接領域のDNAの分離を図った。λファ-ジ上にクロ-ン化したP.denitrificans染色体のXhoIライブラリ-中から、pNO1上のSa1IーHind III 200bpのプロ-ブとハイブリダイズするクロ-ンλーH1、λーX2、またλファ-ジSa1Iライブラリ-から同様にハイブリダイズするクロ-ンλーS1、λーS2、λーS3、λーS4が得られた。一方、P.denitrificansの染色体DNAをXhoIおよびSa1Iで消化したパタ-ンよりこのプロ-ブに対応するXhoI断片は15kb、Sa1I断片は3kb程度と決定した。獲得した6種類のクロ-ンを、Sa1IおよびXhoIで完全消化してサザンハイブリダイゼイションを行ったところ、プロ-ブとハイブリダイズする5種類のXhoI断片およびSa1I断片のクロ-ン化DNAは目的DNAを保持していることを示していた。この5種類のクロ-ン化DNAの制限酵素パタ-ンを調べたところ、Hind IIIーSa1I断片以外が少しずつ異なっており、Hind IIIーSa1I断片を中心として前後に散らばっていることが明かとなり、既にクロ-ン化されている遺伝子の上流に最大3Kbの遺伝子が今回クロ-ン化された。

The nitrification process of removing the sulfate and the desulfation process of the sulfate are carried out at the same timeに行うことを目 Refers to して, anhydrous nitric acid reducing enzyme の缝子のクロ-ン化を trial みている. The purified ammonia nitrate reductase from the previous year's P.denitrificans contains a DNA fragment.をクロ-ン化したが, N-terminal アミノ acid coordination site およびプロモ-タ-をcontaining 5'ーflanking field が无码不了していた. This year's nitric acid reduction enzymes are all active enzymes that are active in nitric acid reduction enzymes.に、缝子があるとLooking forward to されるhis の出suffocation にNecessary なzyme 伝子をクロ-ン化することをtrialみた. P.denitrificans' chromosomal DNAをXhoIでComplete digestionおよびSa1IでPartial digestionしλファ-ジをIt is made of いたXhoI, SalIライブラリ-を, and クロ-ン化された伝子のDNA in the adjacent area is isolated and を図った. λファ-ジ上にクロ-ン化したP.denitrificans chromosomeのXhoIライブラリ-中から、pNO1上のSa1IーHind III 200bpのプロ-ブとハイブリダイズするクロ-ンλーH1、λーX2、またλファ-ジSa1Iライブラリ-から同様にハイブリダイズするクロ-ンλーS1, λーS2, λーS3, λーS4られた. One side, P.denitrificans' chromosome DNAをXhoIおよびSa1Iでdigestionしたパタ-ンよりこのプロ-ブに対応するXhoI fragment is 15kb, Sa1I fragment is 3kb and the degree is decided. Get the 6 types of したのクロ-ンを, Sa1IおよびXhoIでcomplete elimination化してサザンハイブリダイゼイションを行ったところ、プロ-ブとハイブリダイズする5 kinds of のXhoI fragments およびSa1I fragments のクロ-ン化DNAはpurposeDNAをKEEP していることを Show していた.この5 kinds of のクロ-ンDNAのrestricted enzyme パタ-ンを Adjustment べたところ、Hind IIIーSa1I fragment other than が小しずつdifferent なっており、Hind III ーSa1I fragment をcenterとしてbefore and after に三らばっていることが明かとなり、 　　クロ-ン化されている伝子の上流にMaximum 3Kbの伝子がNow return to クロ-ン化された.