遺伝子工学を応用した硝化脱窒過程の解析と高効率化

利用基因工程分析硝化反硝化过程并提高效率

基本信息

批准号：
03202222
负责人：
飯島信司
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1991
资助国家：
日本
起止时间：
1991 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

遺伝子工学を応用して窒素除去を好気的な硝化過程と嫌気的な脱窒過程を同時に行うことを目指して、亜硝酸還元酵素の遺伝子のクロ-ン化を試みている。前年度までにP.denitrificans由来の亜硝酸還元酵素を精製後、亜硝酸還元酵素遺伝子を含むDNA断片をクロ-ン化したが、N末端アミノ酸配列部位およびプロモ-タ-を含む5'ーflanking領域が欠失していた。本年度は、亜硝酸還元遺伝子全体をクロ-ン化して活性のある亜硝酸還元酵素を得るとともに、遺伝子があると期待される他の脱窒に必要な酵素遺伝子をクロ-ン化することを試みた。P.denitrificansの染色体DNAをXhoIで完全消化およびSa1Iで部分消化しλファ-ジを用いたXhoI、Sa1Iライブラリ-を作成し、クロ-ン化された遺伝子の隣接領域のDNAの分離を図った。λファ-ジ上にクロ-ン化したP.denitrificans染色体のXhoIライブラリ-中から、pNO1上のSa1IーHind III 200bpのプロ-ブとハイブリダイズするクロ-ンλーH1、λーX2、またλファ-ジSa1Iライブラリ-から同様にハイブリダイズするクロ-ンλーS1、λーS2、λーS3、λーS4が得られた。一方、P.denitrificansの染色体DNAをXhoIおよびSa1Iで消化したパタ-ンよりこのプロ-ブに対応するXhoI断片は15kb、Sa1I断片は3kb程度と決定した。獲得した6種類のクロ-ンを、Sa1IおよびXhoIで完全消化してサザンハイブリダイゼイションを行ったところ、プロ-ブとハイブリダイズする5種類のXhoI断片およびSa1I断片のクロ-ン化DNAは目的DNAを保持していることを示していた。この5種類のクロ-ン化DNAの制限酵素パタ-ンを調べたところ、Hind IIIーSa1I断片以外が少しずつ異なっており、Hind IIIーSa1I断片を中心として前後に散らばっていることが明かとなり、既にクロ-ン化されている遺伝子の上流に最大3Kbの遺伝子が今回クロ-ン化された。

使用基因工程，我们试图将亚硝酸盐还原酶的基因予以克隆，目的是同时在有氧硝化和厌氧硝化过程中进行氮去除。直到上一年，纯化了源自丹替氏菌的亚硝酸盐还原酶，然后克隆了含有亚硝酸盐还原酶基因的DNA片段，但是将含有N末端氨基酸序列位点的5'-翼型区域和启动子删除。今年，我们试图将整个亚硝酸盐还原基因予以克隆，以获得活跃的亚硝酸盐还原酶，并将预期存在的其他酶基因予以克隆以进行硝化酶。用XHOI完全消化了denitrificans的染色体DNA，并用SA1I部分消化，以使用λ相形成XHOI和SA1I文库，并分离克隆基因的侧翼区域的DNA。从克隆到λ-phage上的P. denitrificans染色体的Xhoi库中，克隆λ-H1，λ-X2与PNO1上的200 bp sa1i-hind III探针杂交，以及克隆λ-S1，λ-S2，λ-S2，λ-S3，λ-S3，λ-s-S4 hybride hambridized sa rage cliblicalized sa sa1i-λ-λ-λ-λ-λ-λ-λ-λ-λ-λ-am-λ-am-λ-am-λ-am-λ-am-c pliceage。另一方面，用XHOI和SA1I消化的Denitrificans染色体DNA的模式被确定为对应于该探针的Xhoi片段为15 kb，对于SA1I片段，对应于该探针，约为3 kb。获得的六种类型的克隆被SA1I和XHOI彻底消化，并进行南部杂交，并表明五种类型的Xhoi和Sa1i片段的克隆DNA与携带靶DNA的探针杂交。当我们研究了这五种类型的克隆DNA的限制酶模式时，据表明，上述HindIII-SA1I片段略有不同，并且散布在前后，主要是Hind III-SA1I片段，并且最多3kB的基因已被锁定在cloneed的基因上，并且已被clonated clonated。