鳥類の胚操作と遺伝子破壊鳥類作製のための基礎研究

鸟类胚胎操作和基因破坏鸟类生产的基础研究

基本信息

批准号：
10876073
负责人：
飯島信司
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10876073/
关键词：
ニワトリウズラ卵巣卵子人工授精孵化始原生殖細胞体外培養

项目摘要

イギリスのペリーによって開発されたニワトリ受精卵の体外培養システムは、雌の輸卵管より放卵される1日前の濃厚卵白のみついた受精卵をとりだし、生体外で培養孵化するもので1細胞期の卵子への遺伝子導入を可能にした。しかし、この方法では、1羽の雌鳥から1つの受精卵しか得られないために効率が悪い。そこで、鳥類の卵巣中より数個の未成熟な卵をin vitroで成熟させ、体外受精を行いトランスジェニッグチキンの孵化までをin vitroで行うことを目的とした。このためモデル系として、取り扱いが簡単なウズラのメスの腹部を解剖し、様々な大きさの未成熟卵子が存在している卵巣を摘出した。最も大きな直径1.5〜2cmの卵子の周りに存在する卵黄膜を注意深く取り除いた後、BSA(3mg/ml)を含むDMEM培地で培養した。またこれよりも小さな卵子はBSA(3mg/ml)、インシュリン(5μg/ml)、トランスフェリン(5μg/ml)、EGF(1ng/ml)を含むDMEM培地で培養した。未成熟卵子の成熟の度合いを示すものとしてGVB(germlnal vesicle breakdown)を観察した。ウズラの雌からﾞ採取した直径が最も大きな約1.5cm卵子とその次に大きな卵子は、解剖後の観察で卵子の周りに存在する卵黄膜を取り除くと卵核胞を確認することができた。また1日培養後にGVBを観察することができた。これらの卵子には黄色卵黄も存在し成熟の可能性も考えられるが、成熟の確認を行うため現在人工受精法を検討している。また卵子に分化する始原生殖細胞を分離する技術を開発し、ウズラ受精卵1個あたり数個の始原生殖細胞を分離し、始原生殖細胞をターゲッティングして遺伝子を導入するシステムを開発した。

佩里（Perry）在英国开发的鸡肉受精卵的体外培养系统将鸡蛋从雌性输卵管释放出来的一天，在雌性输卵管中只有厚的蛋清，并在体外培养，从而使基因转移到一个细胞阶段。但是，这种方法效率低下，因为只能从一只母鸡那里获得一个受精卵。因此，目的是在体外从鸟类的卵巢中成熟几个未成熟的卵，然后在体外受精以在体外孵化转基因鸡。因此，作为模型系统，剖析了雌性鹌鹑的腹部，并消除了存在各种尺寸的未成熟卵的卵巢。仔细去除最大1.5-2 cm直径卵的蛋黄膜，然后在含有BSA（3 mg/ml）的DMEM培养基中培养。将较小的卵培养在含有BSA（3 mg/mL），胰岛素（5μg/mL），转铁蛋白（5μg/ml）和EGF（1 ng/mL）的DMEM培养基中。观察到GVB（种系囊泡分解）指示未成熟卵的成熟程度。最大的直径卵（约1.5厘米）和从雌性鹌鹑中收集的第二大鸡蛋能够确认卵巢膜在卵子后在观察过程中去除卵周围的蛋黄膜时，能够确认排卵囊泡。此外，经过一天的培养后，观察到GVB。这些卵也有黄色的蛋黄，并且可能会成熟，但目前正在考虑确认人造施肥来确认成熟。我们还开发了一项技术，可以将分化为卵的原始生殖细胞分开，并开发了一个系统，该系统将每个受精的鹌鹑卵分开几个原始生殖细胞，靶向原始生殖细胞并引入基因。