遺伝子工学を応用した硝化脱窒過程の解析と高効率化

脱窒菌より窒素除去に必要な酵素遺伝子をクロ-ニングし、組換えDNAの手法を用いて生物的窒素除去を効率化することを目的として、まず脱窒菌Paracoccus denitrificans由来の亜硝酸還元遺伝子をイオン交換クロマトグラフィ-、絡ゲル濾過等の精製手段を用いて、電気泳動的に単一なまでに精製した。最終精製サンプルの比活性は約11U/mg-proteinであった。この酵素の分子量はゲル濾過で濾過98kDaで、SDS-ゲル電気泳動では70kDaであった。また、最終精製サンプルのスペクトルから、本菌の亜硝酸還元酵素はチトクロムcdl型酵素であると考えられる。この酵素の最終精製サンプルとこれをトリプシンで限定加水分解したサンプルとをSDS-ゲル電気泳動で分画した後、気相プロティンシ-クエンサ-によりアミノ酸配列を決定した。酵素のN末端はブロックされており決定できなかったが、トリプシン分解したサンプルの45kDaのバンドについてはアミノ酸配列が決定でき、これに基づいて11種類のDNAプロ-ブを合成した。このプロ-ブを用いて大腸菌コロニ-バンクをスクリ-ニングし、亜硝酸還元酵素遺伝子を含むと考えられる9kbのDNA断片をクロ-ン化した。一方、遺伝子組替えを行なった硝化・脱窒菌を用いて効率的に廃水処理を行うためには、連続的な処理が可能な濾過型バイオリアクタ-が適していると考えられる。そこでセラミック製フィルタ-を用いた膜型バイオリアクタ-を作製し、β-ガラクトシダ-ゼ遺伝子をクロ-ン化した枯草菌を、濾過により増殖阻害物質を除去し新鮮倍地を加えながら培養したところ、OD_<570>で300という高菌体濃度まで培養できた。

脱窒菌より窒素除去に必要な酵素遺伝子をクロ-ニングし、組換えDNAの手法を用いて生物的窒素除去を効率化することを目的として、まず脱窒菌Paracoccus denitrificans由来の亜硝酸還元遺伝子をイオン交換クロマトグラフィ-、絡ゲル濾過等の精製手段を用いて、電気泳動的に単一なまでに精製した。最終精製サンプルの比活性は約11U/mg-proteinであった。この酵素の分子量はゲル濾過で濾過98kDaで、SDS-ゲル電気泳動では70kDaであった。また、最終精製サンプルのスペクトルから、本菌の亜硝酸還元酵素はチトクロムcdl型酵素であると考えられる。この酵素の最終精製サンプルとこれをトリプシンで限定加水分解したサンプルとをSDS-ゲル電気泳動で分画した後、気相プロティンシ-クエンサ-によりアミノ酸配列を決定した。酵素のN末端はブロックされており決定できなかったが、トリプシン分解したサンプルの45kDaのバンドについてはアミノ酸配列が決定でき、これに基づいて11種類のDNAプロ-ブを合成した。このプロ-ブを用いて大腸菌コロニ-バンクをスクリ-ニングし、亜硝酸還元酵素遺伝子を含むと考えられる9kbのDNA断片をクロ-ン化した。一方、遺伝子組替えを行なった硝化・脱窒菌を用いて効率的に廃水処理を行うためには、連続的な処理が可能な濾過型バイオリアクタ-が適していると考えられる。そこでセラミック製フィルタ-を用いた膜型バイオリアクタ-を作製し、β-ガラクトシダ-ゼ遺伝子をクロ-ン化した枯草菌を、濾過により増殖阻害物質を除去し新鮮倍地を加えながら培養したところ、OD_<570>で300という高菌体濃度まで培養できた。