蛍光標識少糖による蛋白質の糖鎖構造認識の解析

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水解酵素やレクチンの分子認識を精度良く解析するには、種々の天然に存在する糖鎖又はそれに類似した複雑な構造の糖鎖を出来るだけ多種類取り揃える必要があり、酵素の場合得られた生成物を精度良く解析する必要がある。この様な蛋白質と糖鎖の結合特異性を解析するためには高感度な解析方法が要求される。ピリジルアミノ(PA-)糖鎖は、分子サイズで分かれるHPLC(サイズフラクショネ-ション)と糖鎖構造で分かれるHPLC(逆相)の二種のカラムを用いる事により、非常に複雑なPA-糖鎖でも微量で分離精製出来る事が今までに明らかとなった。このような構造解析システムは上記目的に適していると思われる。このためウズラの輸卵管をホモジナイザ-を用いてすりつぶし30,000xg上澄を粗酵素標品とし、粗酵素標品中にある、pnitrophenyl αーmannopyranoside等の簡単な構造の基質のみでは検出されない、高度の基質特異性を持ったコバルト依在性αーマンノシダ-ゼの検索を行い分離精製した。このための酵素活性の測定は前年度調製したMan_9GlcNAc_2ーPAやMan_5GlcNAc_2ーPAを基質として用い、酵素反応後、生成物をサイズフラクショネ-ションHPLCを用い蛍光検出器を用いて定量を行った。ここで検出されたαーマンノシダ-ゼについてMan_9GlcNAc_2ーPA〜Man_1GlcNAc_2ーPA等の出来るだけ種々の基質を用い、酵素消化物をサイズフラクショネ-ションHPLCと逆相HPLCで分離解析し、その基質特異性を明らかにした所、Man_9GlcNAcを水解してMan_5GlcNacにする、新しい酵素であることが分った。ニワトリ輸卵管よりウズラと同様な酵素を各種クロマトグラフィ-を用い精製し単一な蛋白質とし、酵素の基質特異性の解析を行なう予定である。