蛍光標識少糖による蛋白質の糖鎖構造認識の解析

使用荧光标记寡糖分析蛋白质碳水化合物链结构识别

• 批准号: 03236226
• 负责人: 長谷 純宏
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1991
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1991 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-03236226/
• 关键词: 蛍光標識; マンノシダ-ゼ; 酵素; 輸卵管; コバルト; HPLC; 逆相; 基質特異性

水解酵素やレクチンの分子認識を精度良く解析するには、種々の天然に存在する糖鎖又はそれに類似した複雑な構造の糖鎖を出来るだけ多種類取り揃える必要があり、酵素の場合得られた生成物を精度良く解析する必要がある。この様な蛋白質と糖鎖の結合特異性を解析するためには高感度な解析方法が要求される。ピリジルアミノ(PA-)糖鎖は、分子サイズで分かれるHPLC(サイズフラクショネ-ション)と糖鎖構造で分かれるHPLC(逆相)の二種のカラムを用いる事により、非常に複雑なPA-糖鎖でも微量で分離精製出来る事が今までに明らかとなった。このような構造解析システムは上記目的に適していると思われる。このためウズラの輸卵管をホモジナイザ-を用いてすりつぶし30,000xg上澄を粗酵素標品とし、粗酵素標品中にある、pnitrophenyl αーmannopyranoside等の簡単な構造の基質のみでは検出されない、高度の基質特異性を持ったコバルト依在性αーマンノシダ-ゼの検索を行い分離精製した。このための酵素活性の測定は前年度調製したMan_9GlcNAc_2ーPAやMan_5GlcNAc_2ーPAを基質として用い、酵素反応後、生成物をサイズフラクショネ-ションHPLCを用い蛍光検出器を用いて定量を行った。ここで検出されたαーマンノシダ-ゼについてMan_9GlcNAc_2ーPA〜Man_1GlcNAc_2ーPA等の出来るだけ種々の基質を用い、酵素消化物をサイズフラクショネ-ションHPLCと逆相HPLCで分離解析し、その基質特異性を明らかにした所、Man_9GlcNAcを水解してMan_5GlcNacにする、新しい酵素であることが分った。ニワトリ輸卵管よりウズラと同様な酵素を各種クロマトグラフィ-を用い精製し単一な蛋白質とし、酵素の基質特異性の解析を行なう予定である。

The molecular understanding of hydrolytic enzymes is analyzed with good accuracy. The sugar lock is naturally present in the enzyme species. The sugar lock is similar to the sugar lock in the complex structure. The sugar lock is extracted from the enzyme species. The product is analyzed with good accuracy. The binding specificity of these proteins and glycans is analyzed with high sensitivity analysis methods. Two kinds of HPLC(reverse-phase) systems were used in the separation and purification of PA-glycans, which were isolated from PA-glycans by HPLC(reverse-phase). The structure analysis method is used to record the purpose of the method. The matrix of simple structure such as crude enzyme standard, crude enzyme standard, pnitrophenyl α-mannopyranoside, etc. is isolated and purified from the matrix with high matrix specificity. The enzyme activity of the enzyme was determined by HPLC using a light detector and a quantitative method. The matrix of the enzyme digest was separated and analyzed by HPLC and reverse-phase HPLC. The matrix specificity of the enzyme digest was determined. The hydrolysis of Man_9GlcNAc was determined by Man_5GlcNac. The analysis of protein and enzyme matrix specificity in oviduct

项目成果

K.Omichi: "Studies on the Active Site of Human αーAmylase:Examination of the Third Subsite S3' of the AglyconeーBinding Site by Control of Substrate Binding Mode" J.Biochem.111. 4-7 (1992)

K.Omichi：“人 α-淀粉酶活性位点的研究：通过控制底物结合模式检查糖苷配基结合位点的第三个亚位点 S3”J.Biochem.111（1992）。

H.Oku: "Studies on the Substrate Specificity of Neutral αーMannosidase Purified from Japanese Quail Oviduct by Using Sugar Chains from Glycoproteins" J.Biochem.110. 982-989 (1991)

H.Oku：“使用糖蛋白糖链从日本鹌鹑输卵管中纯化中性 α-甘露糖苷酶的底物特异性的研究”J.Biochem.110（1991）。

T.Mega: "Determination of LectinーSugar Binding Constants by Microequilibrium Dialysis Coupled with High Performance Liquid Chromatography" J.Biochem.109. 600-603 (1991)

T.Mega：“通过微平衡透析与高效液相色谱法测定凝集素-糖结合常数”J.Biochem.109（1991）。

長谷 純宏: "複合糖質の糖鎖研究における新しい方法論とその展望ーピリジルアミノ化の役割ー" 生化学63, 11 (1991)

Yoshihiro Hase：“复杂碳水化合物碳水化合物链研究的新方法和前景——吡啶胺化的作用” 生物化学 63, 11 (1991)

H.Watzlawick: "The Effect of the Carbohydrate Moiety upon the Size and Conformation of Human Plasma Galactoglycoprotein as Judged by Electron Microscopy and Circular Dichroism" Biochem.J.277. 753-758 (1991)

H.Watzlawick：“通过电子显微镜和圆二色性判断碳水化合物部分对人血浆半乳糖蛋白大小和构象的影响”Biochem.J.277。