蛍光標識少糖による蛋白質の糖鎖構造認識の解析

使用荧光标记寡糖分析蛋白质碳水化合物链结构识别

• 批准号: 04220225
• 负责人: 長谷 純宏
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1990
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1990 至 1992
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-04220225/
• 关键词: HPLC; 蛍光標識; ピリジアルアミノ化; マンノシダーゼ; 酵素; ニワトリ

水解酵素やレクチンの分子認識を精度良く解析するには、種々の天然に存在する糖鎖又はそれに類似した複雑な構造の糖鎖を出来るだけ多種類取り揃える必要があり、酵素の場合得られた生成物を精度良く解析する必要がある。この様な蛋白質と糖鎖の結合特異性を解析するためには高感度な解析方法が要求される。ピリジルアミノ(PA-)糖鎖は分子サイズで分かれるHPLC(サイズフラクショネーション)と糖鎖講造で分かれるHPLC(逆相)の二種のカラムを用いる事により、非常に複雑なPA-糖鎖でも微量で分離精製出来る事が今までに明らかとなった。このような構造解析システムは上記目的に適していると思われる。本研究は糖鎖の活性発現の解析の第一歩として、複雑な構造の糖鎖を用い、ウズラおよびニワトリ輸卵管のコバルト依存性α-マンノシダーゼの基質特異性を高精度で解析する事が目的である。前年度迄に、ウズラ輸卵管のコバルト依存性α-マンノシダーゼについて、精製と基質特異性を調べた。本年度はニワトリ輸卵管のコバルト依存性α-マンノシダーゼについて同様の研究を計画した。ニワトリの輸卵管をホモジナイザーを用いてすりつぶし、30,000xg上澄を粗酵素標品中にある、p-nitrophenyl α-mannopyranoside等の簡単な構造の基質では検出されない、ウズラと同様の高度の基質特異性を持ったコバルト依存性α-マンノシダーゼの検索を行なった。このために、酵素活性の測定は初年度調製したMan_5 GlcNAc_2-PAやMan_9 GlcNAc_2-PAを基質として用い酵素反応後、生成物をサイズフラクショネーションHPLCと蛍光検出器を用いて定量した。粗酵素標品より、0-30%硫安塩析、DEAE、オクチルセファロース、セファアクリルS-300、MonoQ、ハイドロキシアパタイトの各クロマトグラフィーを行って現在精製中である。これで精製が完了すると基質特異性が解析できる。

The molecular understanding of hydrolytic enzymes is analyzed with good accuracy. The sugar lock is naturally present in the enzyme species. The sugar lock is similar to the sugar lock in the complex structure. The sugar lock is extracted from the enzyme species. The product is analyzed with good accuracy. The binding specificity of these proteins and glycans is analyzed with high sensitivity analysis methods. The separation and purification of PA-glycolate by HPLC(reverse phase) and HPLC(reverse phase) are very important for the separation and purification of PA-glycolate. The structure analysis method is used to record the purpose of the method. This study is the first step in the analysis of the activity of glycogen lock. The purpose of this study is to analyze the substrate specificity of glycogen lock with high accuracy. In the past year, it has been found that the dependence of tubal cells on α-βThis year, we plan to study the dependence of oviduct on α- A simple matrix structure such as p-nitrophenyl α-mannopyranoside, p-nitrophenyl The enzyme activity was measured by HPLC and UV detector. The crude enzyme standard, 0-30% sulfur analysis, DEAE, deacetylation, deacetylation S-300, monoQ, deacetylation, deacetylation, deacetylation. The purification is complete and the matrix specificity is resolved.

项目成果

K.Fukase: "Synthesis of New Serine-Linked Oligosaccharides in Blood-Clotting Factors VII and IX and Protein Z." Bull.Chem.soc.Jpn.65. 436-445 (1992)

K.Fukase：“凝血因子 VII 和 IX 以及蛋白 Z 中新型丝氨酸连接寡糖的合成”。

S.Hase: "Conversion of Pyridylamino Sugar Chains to l-Amino-l-Deoxy Derivatives,Intermediates for Tagging with Fluorescein and Biotin" J.Biochem.112. 266-268 (1992)

S.Hase：“将吡啶氨基糖链转化为 L-氨基-L-脱氧衍生物、用于荧光素和生物素标记的中间体”J.Biochem.112。

H.Nishimura: "Human Factor IX Has a Tetrasaccharide O-Glycosidically Linked to Serine 61 through the Fucose Residue" J.Biol.Chem.267. 17520-17525 (1992)

H.Nishimura：“人类因子 IX 具有通过岩藻糖残基与丝氨酸 61 相连的四糖 O-糖苷”J.Biol.Chem.267。

長谷 純宏: "複合糖質ピリジルアミノ化糖鎖とその応用,蛋白質核酸酵絵、37" 共立出版, 6 (1992)

Sumihiro Hase：“复杂碳水化合物的吡啶胺化糖链及其应用，蛋白质核酸发酵的说明，37”Kyoritsu Shuppan，6（1992）

N.Kuraya: "Release of O-Linked Sugar Chains from Glycoproteins with Anhydrous Hydrazine and Pyridylamination of the Sugar Chains with Improved Reaction Condieions" J.Biochem.112. 122-126 (1992)

N.Kuraya：“用无水肼从糖蛋白中释放 O-连接糖链，并通过改进的反应条件对糖链进行吡啶胺化”J.Biochem.112。