蛍光標識少糖による蛋白質の糖鎖構造認識の解析

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水解酵素やレクチンの分子認識を精度良く解析するには、種々の天然に存在する糖鎖又はそれに類似した複雑な構造の糖鎖を出来るだけ多種類取り揃える必要があり、酵素の場合得られた生成物を精度良く解析する必要がある。この様な蛋白質と糖鎖の結合特異性を解析するためには高感度な解析方法が要求される。ピリジルアミノ(PA-)糖鎖は分子サイズで分かれるHPLC(サイズフラクショネーション)と糖鎖講造で分かれるHPLC(逆相)の二種のカラムを用いる事により、非常に複雑なPA-糖鎖でも微量で分離精製出来る事が今までに明らかとなった。このような構造解析システムは上記目的に適していると思われる。本研究は糖鎖の活性発現の解析の第一歩として、複雑な構造の糖鎖を用い、ウズラおよびニワトリ輸卵管のコバルト依存性α-マンノシダーゼの基質特異性を高精度で解析する事が目的である。前年度迄に、ウズラ輸卵管のコバルト依存性α-マンノシダーゼについて、精製と基質特異性を調べた。本年度はニワトリ輸卵管のコバルト依存性α-マンノシダーゼについて同様の研究を計画した。ニワトリの輸卵管をホモジナイザーを用いてすりつぶし、30,000xg上澄を粗酵素標品中にある、p-nitrophenyl α-mannopyranoside等の簡単な構造の基質では検出されない、ウズラと同様の高度の基質特異性を持ったコバルト依存性α-マンノシダーゼの検索を行なった。このために、酵素活性の測定は初年度調製したMan_5 GlcNAc_2-PAやMan_9 GlcNAc_2-PAを基質として用い酵素反応後、生成物をサイズフラクショネーションHPLCと蛍光検出器を用いて定量した。粗酵素標品より、0-30%硫安塩析、DEAE、オクチルセファロース、セファアクリルS-300、MonoQ、ハイドロキシアパタイトの各クロマトグラフィーを行って現在精製中である。これで精製が完了すると基質特異性が解析できる。