核蛋白質による十字型DNA構造の特異的識別・結合の様式および同構造解消の機構

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1.HMG box、およびDNAとHMG boxとの複合体の立体構造解析:HMG2のcDNAよりDNA結合領域“HMG box"A,BおよびA+BをコードするcDNAをTクプロモーターをもつプラスミドpGEMに組み込み、大腸菌の中で単独分子として、それぞれ高発現できる系を確立した。高発現したポリペプチドをそれぞれ分離精製する方法を見いだした。現在、多量の試料を調製中であり、引きつづき大阪大学との共同研究により、結晶化とX線回折、およびNMPによる立体構造解析を行なう。2、HMG boxとDNAとの結合様式の解明:HMG boxとDNAとの結合を解析するためのゲルシフトアッセイ条件を設定した。この系でHMG2のHMG boxBとプラミドDNAとの結合と測定したところ、超らせん型、弛緩型、直鎖型のいずれのDNA型にも同程度の結合を示し、また超らせん型DNAへの結合の程度はHMG2に比較して弱かった。これらの結果から、HNG2の超らせん型DNAに対する強い、優先的結合にはHMG boxA,Bの2つが相揃い、その相互作用が必須であることが示された。3、転写反応におけるHMG boxの影響解析:動物培養細胞COS-1における外来遺伝子の発現活性によりHMG1の効果を検定したところ、HMG1の発現に伴い、外来遺伝子の発現が数倍増加した。さらに、この発現上昇は転写段階での促進によることが明らかになった。一方、HMG1の変異タンパク質を構築し、その発現に対する影響を検索した結果、HNG boxA+Bのみではレポータ遺伝子の発現が抑えられた。この結果、HMG boxはDNA結合活性を有するのみであり、HMG1分子のC末端の酸性アミノ酸領域が転写領域が転写促進の機能をドメインであることが明りかとなった。