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HMGタンパク質のDNA結合ドメイン構造と認識機構の解析

HMG蛋白DNA结合域结构及识别机制分析

基本信息

批准号：
08260218
负责人：
吉田充輝
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Tokyo University of Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.HMG2のDNA結合領域の構造解析:HMG2のcDNAよりドメインAB(AとBがリンカーを挟んで連結した配列を大腸菌で高発現させ、均一になるまで精製する系を確立した。この系を用いて、同位体で標識した試料を調製し、現在大阪大学蛋白質研究所など3研究機関の協力のもとNMRによる高次構造解析を進行中である。また、奈良先端技術大学院大学の協力のもとにDNAとの複合体についてX線回折による解析も同時進行中である。2.部位特異的変異を導入したHMG2のDNA結合領域をもちいた結合機構の解析:立体構造保持(疎水性コアを形成する疎水性アミノ酸)やDNAとの結合(塩基性アミノ酸)、インタカレーションに関与すると期待されるアミノ酸残基を部位特異的変異法により他残基に置換したドメインBを大腸菌で高発現させ、精製した。これら変異体とDNAとの相互作用をゲルシフトアッセイ、表面プラズモン共鳴現象を測定するBIAcore装置によって解析したところ、全ての変異体で結合能の変化と立体構造の差異が観察された。以上の結果より、これらのアミノ酸の構造保持と結合における重要性を明らかにした。3.示差走査熱量計をもちいたDNA-HMG2複合体の熱安定性の解析:DNAとの複合体の安定性を測定する前段階としてペプチド単独で測定を行なった。その結果、加熱とともにペプチドが凝集し、測定が不可能となった。現在、凝集の原因と考えられるシステイン残基に変異を導入したペプチドを調製し、解析を行なっている。4.新しいDNA結合タンパク質EPF-5の構造解析:DNA結合機構の解析の一環として、花の組織の特異的発現に関与するZn-Finger型DNA結合性タンパク質EPF-2-5のNMRによる高次構造解析を進行中である。

1. Structural analysis of DNA binding domain of HMG2: The cDNA sequence of HMG2 was established. The system is currently in the process of preparation of samples for isotope identification and NMR analysis in collaboration with three research institutes at Osaka University. Nara Advanced Institute of Technology University's collaborative work on DNA and DNA complexes, X-ray folding, analysis, and simultaneous progress 2. The site-specific variation is introduced into the DNA binding domain of HMG2, and the binding mechanism is analyzed. The steric structure is maintained (the formation of the aqueous acid), and the DNA binding (the basic acid) is analyzed. The expected site-specific variation of the acid residue is analyzed. The substitution of other residues is analyzed. The interaction between heterogeneic DNA and surface resonance phenomena was determined by BIAcore device, and the differences in binding energy and stereo structure were observed. The above results show the importance of structural preservation and bonding. 3. Analysis of the thermal stability of the DNA-HMG2 complex using a differential calorimeter: The first step and the first step in determining the stability of the DNA complex are performed independently. The results of heating and coagulation are impossible. Now, the reason for aggregation is that the residue is different from each other. 4. Structural analysis of novel DNA-binding protein EPF-5: Analysis of DNA binding mechanism and molecular structure of Zn-Finger type DNA binding protein EPF-2-5 related to the development of specific flower tissues are in progress.