HMGタンパク質のDNA結合ドメイン構造と認識機構の解析

HMG蛋白DNA结合域结构及识别机制分析

• 批准号: 08260218
• 负责人: 吉田 充輝
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: Tokyo University of Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08260218/
• 关键词: HMG1タンパク質; HMG2タンパク質; DNA結合性タンパク質; クロマチン; 表面プラズモン共鳴; ヌクレオソーム; タンパク質工学; HMGボックス

1.HMG2のDNA結合領域の構造解析:HMG2のcDNAよりドメインAB(AとBがリンカーを挟んで連結した配列を大腸菌で高発現させ、均一になるまで精製する系を確立した。この系を用いて、同位体で標識した試料を調製し、現在大阪大学蛋白質研究所など3研究機関の協力のもとNMRによる高次構造解析を進行中である。また、奈良先端技術大学院大学の協力のもとにDNAとの複合体についてX線回折による解析も同時進行中である。2.部位特異的変異を導入したHMG2のDNA結合領域をもちいた結合機構の解析:立体構造保持(疎水性コアを形成する疎水性アミノ酸)やDNAとの結合(塩基性アミノ酸)、インタカレーションに関与すると期待されるアミノ酸残基を部位特異的変異法により他残基に置換したドメインBを大腸菌で高発現させ、精製した。これら変異体とDNAとの相互作用をゲルシフトアッセイ、表面プラズモン共鳴現象を測定するBIAcore装置によって解析したところ、全ての変異体で結合能の変化と立体構造の差異が観察された。以上の結果より、これらのアミノ酸の構造保持と結合における重要性を明らかにした。3.示差走査熱量計をもちいたDNA-HMG2複合体の熱安定性の解析:DNAとの複合体の安定性を測定する前段階としてペプチド単独で測定を行なった。その結果、加熱とともにペプチドが凝集し、測定が不可能となった。現在、凝集の原因と考えられるシステイン残基に変異を導入したペプチドを調製し、解析を行なっている。4.新しいDNA結合タンパク質EPF-5の構造解析:DNA結合機構の解析の一環として、花の組織の特異的発現に関与するZn-Finger型DNA結合性タンパク質EPF-2-5のNMRによる高次構造解析を進行中である。

1. HMG2 の dna-binding domain の structure: HMG2 の cDNA よ り ド メ イ ン AB (と B が リ ン カ ー を carry ん で link し た match column を coliform で high 発 now さ せ, uniform に な る ま で refined す を る department establish し た. こ の is を with い て で logo, with a body し た sample を し modulation, Osaka university institute of protein now な ど 3 research machine masato の together の も と NMR に よ る during high tectonic analytical を で あ る. ま た, nara apex technology university college の together の も と に DNA と の complex に つ い て X-ray inflexion に よ る parsing も simultaneously in で あ る. 2. Site specific - different を import し た HMG2 の dna-binding domain を も ち い た combining institutions の analytic: three-dimensional structure keep (疎 water-based コ ア を form す る 疎 water-based ア ミ ノ acid) や DNA と の combination (salt base ア ミ ノ acid), イ ン タ カ レ ー シ ョ ン に masato and す る と expect さ れ る ア ミ ノ acid residues を site specific - different に よ り His residues are に substituted for たドメ たドメ た Bを coliform で, with a high occurrence of させ and refinement of た た. こ れ ら - variant DNA と と の interaction を ゲ ル シ フ ト ア ッ セ イ, surface プ ラ ズ モ ン resonance phenomenon を determination す る BIAcore device に よ っ て parsing し た と こ ろ, whole て の - variant で binding energy の variations change と three-dimensional structure difference の が 観 examine さ れ た. Results above の よ り, こ れ ら の ア ミ ノ acid の structure keep と with に お け る importance を Ming ら か に し た. 3. The differential walkthrough calorimeter を も ち い た DNA - HMG2 complex thermal stability の の analytic: DNA と の complex の stability determination of を す る earlier order と し て ペ プ チ ド 単 で alone determine line を な っ た. Youdaoplaceholder0 そ result, heating とと そ にペプチドが にペプチドが agglutination, determination が impossible となった. Now, condense the cause of と, study えられるシステ and えられるシステ residues に, change を, import <s:1> たペプチドを modulation <s:1>, analyze を lines なって る る る る る. 4. New し い dna-binding タ ン パ ク qualitative EPF - 5 の structure: DNA binding agency の analytic の a ring と し て, flower の の specific 発 now に masato and す る type zinc Finger - DNA associativity タ ン パ ク qualitative EPF - 2-5 の NMR に よ る during high tectonic analytical を で あ る.

项目成果

Sobajima, J.: "Novel autoantigens of perinuclear anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (P-ANCA) in ulcerative colitis : non-histone chromosomal proteins, HMG1 and HMG2." Clin.Exp.Immunol.107. 135-140 (1997)

Sobajima, J.：“溃疡性结肠炎中核周抗中性粒细胞胞浆抗体 (P-ANCA) 的新型自身抗原：非组蛋白染色体蛋白、HMG1 和 HMG2。”

Nakamura,Y.: "Identification of DNA-bending and unwinding regions in HMG2" Nucleic Acids Sym.Ser.35. 267-268 (1996)

Nakamura,Y.：“HMG2 中 DNA 弯曲和解旋区域的鉴定”核酸 Sym.Ser.35。

吉田充輝: "HMGボックスタンパク質による転写複合体の骨格構築" 生化学. 68. 1829-1834 (1996)

Mitsuteru Yoshida：“HMG 盒蛋白转录复合物的支架构建”《生物化学》68。1829-1834 (1996)

Shirakawa, H.: "Nuclear accumulation of HMG2 protein is mediated by basic regions interspaced with a long DNA-binding sequence, and retention within the nucleus requires the acidic carboxyl-terminus." Biochemistry. 36 (in press). (1997)

Shirakawa, H.：“HMG2 蛋白的核积累是由长 DNA 结合序列间隔的碱性区域介导的，并且保留在细胞核内需要酸性羧基末端。”