アポ酵素との複合体形成によるビタミンB_<12>補酵素の活性化と機能発現

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1.姫路工大安岡教授のグループとの共同研究により、組換え体ジオールデヒドラーゼの結晶化に一部成功し、X線結晶解析の予備的なデーターの収集を行った。2.ジオールデヒドラーゼのα,β,γサブユニット毎の大量発現系を開発して活性な立体構造形成に必要な条件について検討し、1)α/γが活性な立体構造を形成するにはそれぞれ他方の存在が不可欠であること、2)βの活性な立体構造形成は単独でも一部は可能であるが、全てが活性な立体構造を形成するにはα/γの共存が必要であることを強く示唆する結果を得た。3.グリセロールデヒドラーゼ遺伝子のクローン化および大量発現系の開発を行った。K.pneumoniaeよりジオールデヒドラーゼ遺伝子と相同性のある遺伝子をクローン化した。それらの遺伝子を大腸菌で発現させ、その酵素化学的諸性質を解析することで、今回クローン化した遺伝子がグリセロールデヒドラーゼ遺伝子であることを確認した。次にグリセロールデヒドラーゼのサブユニット遺伝子を、発現ベクターpUSI2Eに組み込んで大腸菌に導入し、IPTGで誘導をかけると、その発現量は親菌の20倍以上に達した。4.補酵素のヌクレオチド部の塩基を置換したアナログを用いてジオールデヒドラーゼ反応中のEPRスペクトルを測定したところ、アナログの補酵素活性と相関のあるスペクトルが得られ、反応中のラジカル中間体の安定化にはかさ高な塩基の配位によるコリン環の上方へのひずみが重要な役割を果たしていることが示唆された。5.酵素に結合したコバラミンの下方配位子であるDBI部が酵素のHis残基のイミダゾールによって置換されているかどうかを決定するために、^<15>N標識酵素を調製してEPRによる検討を行った結果、本酵素では、DBIのHis残基による置換が起こっていないことを明らかにした。