アポ酵素との複合体形成によるビタミンB_<12>補酵素の活性化と機能発現

通过与脱辅基酶形成复合物来激活维生素 B_<12> 辅酶并进行功能表达

• 批准号: 07229234
• 负责人: 虎谷 哲夫
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07229234/
• 关键词: ジオールデヒドラーゼ; グリセロールデヒドラーゼ; ビタミンB_<12>補酵素; EPR; グリセロールデヒドラーゼ遺伝子

1.姫路工大安岡教授のグループとの共同研究により、組換え体ジオールデヒドラーゼの結晶化に一部成功し、X線結晶解析の予備的なデーターの収集を行った。2.ジオールデヒドラーゼのα,β,γサブユニット毎の大量発現系を開発して活性な立体構造形成に必要な条件について検討し、1)α/γが活性な立体構造を形成するにはそれぞれ他方の存在が不可欠であること、2)βの活性な立体構造形成は単独でも一部は可能であるが、全てが活性な立体構造を形成するにはα/γの共存が必要であることを強く示唆する結果を得た。3.グリセロールデヒドラーゼ遺伝子のクローン化および大量発現系の開発を行った。K.pneumoniaeよりジオールデヒドラーゼ遺伝子と相同性のある遺伝子をクローン化した。それらの遺伝子を大腸菌で発現させ、その酵素化学的諸性質を解析することで、今回クローン化した遺伝子がグリセロールデヒドラーゼ遺伝子であることを確認した。次にグリセロールデヒドラーゼのサブユニット遺伝子を、発現ベクターpUSI2Eに組み込んで大腸菌に導入し、IPTGで誘導をかけると、その発現量は親菌の20倍以上に達した。4.補酵素のヌクレオチド部の塩基を置換したアナログを用いてジオールデヒドラーゼ反応中のEPRスペクトルを測定したところ、アナログの補酵素活性と相関のあるスペクトルが得られ、反応中のラジカル中間体の安定化にはかさ高な塩基の配位によるコリン環の上方へのひずみが重要な役割を果たしていることが示唆された。5.酵素に結合したコバラミンの下方配位子であるDBI部が酵素のHis残基のイミダゾールによって置換されているかどうかを決定するために、^<15>N標識酵素を調製してEPRによる検討を行った結果、本酵素では、DBIのHis残基による置換が起こっていないことを明らかにした。

1. The joint research of Professor Yasuoka of the National University of Technology was carried out successfully in the preparation of X-ray crystallization analysis. 2. α,β,γ-α, γ-β,γ-α, γ-β-All active stereo structures are formed so that alpha/gamma shift is necessary. 3. The development of a large number of development systems is carried out in the field of environmental protection. K.pneumoniae The analysis of the properties of the enzyme chemistry and the development of E. coli as well as the identification of the enzyme properties of E. coli In addition, the amount of IPTG induced in Escherichia coli was more than 20 times that of the parent bacteria. 4. The enzyme activity and related factors of the enzyme were determined in the presence of the ligand in the middle of the enzyme, and the ligand in the middle of the enzyme was determined in the presence of the ligand in the middle of the enzyme. 5. The enzyme binds to the lower ligand of the DBI moiety and the substitution of the enzyme's <15>His residue is determined.

项目成果

Yusuke TAKAHATA: "Synthesis,Properties and Microbiological Activity of Hydrophobic Derivative of Vitamin B_<12>" Journal of Nutritional Science and Vitaminology. 41. 515-526 (1995)

Yusuke TAKAHATA：“维生素 B_<12> 疏水衍生物的合成、性质和微生物活性”营养科学与维生素学杂志。

Takamasa TOBIMATSU: "Molecular Cloning,Sequencing, and Expression of the Genes Encoding Adenosylcobalamin-Dependent Diol Dehydrase of Klebsiella oxytoca" Journal of Biological Chemistry. 270. 7142-7148 (1995)

Takamasa TOBIMATSU：“产酸克雷伯菌腺苷钴胺依赖性二醇脱水酶编码基因的分子克隆、测序和表达”生物化学杂志。

虎谷哲夫: "酵素反応におけるラジカル触媒を考える" 化学と生物. 33. 224-233 (1995)

Tetsuo Toratani：“考虑酶反应中的自由基催化剂”化学与生物学 33. 224-233 (1995)。