アデノシルコバラミンの補酵素活性の発現と維持に関わる蛋白質の機能解析

参与腺苷钴胺素的表达和辅酶活性维持的蛋白质的功能分析

• 批准号: 08249226
• 负责人: 虎谷 哲夫
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08249226/
• 关键词: ビタミンB_<12>補酵素; アデノシルコバラミン; ラジカル; 電子常磁性共鳴; 自殺不活性化; ジオールデヒドラーゼ; グリセロールデヒドラーゼ; 遺伝子クローン化

1.基質による酵素反応中の不活性化の電子常磁性共鳴(EPR)を用いた解析アデノシルコバラミン(ビタミンB_<12>補酵素)関与ジオールデヒドラーゼ(DD)の基質による酵素反応中の不活性化とEPRスペクトルとの関係を調べた。反応開始直後のスペクトルには、基質として用いた1,2-prooandiol、1,2-ethanediol、meso-2,3-butanediol、glycerolのいずれにおいても、cob(II)alaminのCo(II)由来の幅広いシグナルと、有機ラジカル由来の2重線がみられた。この2重線はCo(II)上の不対電子とのスピン-スピン結合によるもので、結合定数はこの順に減少した。一方、不活性化速度定数はこの順に増大した。結合定数は両スピン間の距離が長いほど減少することから、反応中の有機ラジカルとCo(II)には至適な距離があり、これよりも遠くなるほど酵素反応中のラジカル中間体の制御が困難となり、不活性化が起こり易くなることが示唆された。2.アデノシルコバラミン関与グリセロールデヒドラーゼ(GD)遺伝子のクローニングと塩基配列の解析および大量発現GDとDDとは、アデノシルコバラミンへの親和性や基質特異性などが異なるアイソザイムである。DDのみならず、GDについても作用機作を分子レベルで解明する目的で、Klebsiella pneumoniae GD遺伝子をKlebsiella oxytoca DD遺伝子とのクロスハイブリッド形成により単離し,大腸菌で大量発現させた。組換え体には親菌の14倍の酵素活性が認められた。得られた酵素は,諸性質が親菌のGDと一致し,61K(α),22K(β),16K(γ)のサブユニットから成ることが示された。塩基配列の解析により、3つの遺伝子(gldA,gldB,gldC)が連続して存在し,それぞれ,分子量60,659(α),21,355(β),16,104(γ)のポリペプチドをコードしていることが明らかとなった。塩基配列から推定されたアミノ酸配列はDDの対応するサブユニットと高い相同性を示した。

1. The relationship between electron resonance (EPR) and inactivation in substrate enzyme reaction was investigated<12>. After the start of the reaction, the substrate was used in the presence of 1,2-propanol, 1,2-ethanol, meso-2,3-butanediol and glycerol. The origin of cob(II)alamin in Co(II) was determined by the amplitude of the molecule and the origin of the organic molecule. The number of electrons on Co(II) decreases with the number of electrons on Co(II) One side, deactivation speed fixed number and increase in order. The distance between the binding constant and the enzyme is long, the distance between the enzyme and the intermediate is long, and the distance between the enzyme and the intermediate between the enzyme. 2. The affinity and matrix specificity of GD and DD gene were detected by the analysis of GD gene and its base alignment. DD gene, GD gene, GD gene, Klebsiella pneumoniae, GD gene, Klebsiella oxytoca DD gene, GD gene, E. coli, etc. The enzyme activity of the parent bacteria was 14 times higher than that of the control group. The properties of the enzyme are consistent with those of the parent bacteria,61K(α),22K(β),16K(γ) and 16K(γ). The molecular weights of the three molecules (gldA,gldB,gldC) are 60,659(α), 21,355 (β), 16,104 (γ). The base alignment is presumed to be identical to the base alignment.

项目成果

Toraya,T.,Yamanishi,M.,et al.: "An electron paramagnetic resonance study on the mechanism-based inactivation of adenosylcobalamin-dependent diol dehydrase by glycerol and other substrates" Biochem.Biophys.Acta. (in press). (1996)

Toraya,T.,Yamanishi,M.,et al.：“甘油和其他底物对腺苷钴胺依赖性二醇脱水酶失活机制的电子顺磁共振研究”Biochem.Biophys.Acta。

Tobimatsu,T.,Toraya,T.,et al.: "Cloning,sequencing,and high level expression of the genes encoding adenosylcobalamin-dependent glycerol dehydrase of Klebsiella pneumoniac" J.Biol.Chem.271. 22352-22357 (1996)

Tobimatsu,T.,Toraya,T.,et al.：“肺炎克雷伯菌腺苷钴胺依赖性甘油脱水酶编码基因的克隆、测序和高水平表达”J.Biol.Chem.271。