酵素によるビタミンB_<12>補酵素の構造認識と補酵素機能の発現

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1.酵素によるビタミンB_<12>補酵素のヌクレオチド部の構造認識と補酵素機能の発現B_<12>補酵素(アデノシルコバラミン;AdoCbl)の下方配位子のリボ-ス部を2〜6個のメチレン鎖で置換したアナログ、及びトリメチレン体の5,6ージメチルベンズイミダゾ-ル(DBI)部をイミダゾ-ル(Im)で置換したアナログを合成し、ジオ-ルデヒドラ-ゼを用いて補酵素機能を調べた。その結果、DBI部とリン酸部の連結鎖長が天然型に近いトリメチレン体とテトラメチレン体アナログはAdoCblのそれぞれ59%及び50%の活性を保持していたが、連結鎖がこれより長くなっても短かくなっても活性は失われ、酵素との親和性も低下することが分かった。従って、リボ-ス部はDBI部を適切な距離と方向に保つスペ-サ-としての役割を果たしていると考えられる。Ado型のImトリメチレン体は、初速度でみると8.2%の活性を示したが、反応中に天然補酵素の400倍以上も高い確率で酵素の不活性化を引き起こした。従って、AdoCblのDBIのジメチルベンゾ部分は、補酵素機能発現に重要であるばかりでなく、反応中間体の安定化を通じて酵素の不活性化を防止する役割も果たしていると結論される。2.ジオ-ルデヒドラ-ゼ遺伝子のクロ-ニング<Klebsiella>___ー <oxytoca>___ー ATCC8724のゲノムDNAより、ゲノムDNAライブラリ-を調製した。ジオ-ルデヒドラ-ゼの部分アミノ酸配列より予測された塩基配列を持つ50merの合成オリゴDNAをプロ-ブとして、このゲノムDNAライブラリ-をスクリ-ニングし、約4,000クロ-ンより11個のハイブリダイゼ-ションポジティブクロ-ンを単離した。これら11個のクロ-ンをグリセロ-ルおよび1,2ープロパンジオ-ルを炭素源とする培地で好気培養した後、酵素活性を測定したところ、2個のクロ-ンが<K.>___ー <oxytoca>___ー ATCC8724に匹敵する高い比活性を示した。