B12酵素とその分子シャペロン様再活性化因子との超分子複合体の立体構造解析

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我々は不活性化されたB_<12>補酵素関与ジオールデヒドラターゼ(DD)ホロ酵素を再活性化するDD再活性化因子(DDR)を発見し、生化学的および結晶構造学的解析を行って作用機作を明らかにしてきた。本研究では、DDおよびDDRの結晶構造解析の結果からDD-DDR複合体の形成に重要であると予測されるアミノ酸残基に変異を導入した変異型蛋白質の作成と機能解析、ATPアナログ結合型DDRの結晶構造解析、DD-DDR超分子複合体の結晶化、の3点について研究を行った。まず、変異型DDRと野生型DDを共発現した大腸菌の透過性菌体の系を用いて、グリセロールで不活性化されたDDの再活性化を調べた結果とDDおよびDDRの立体構造から、DD-DDR複合体中ではDDRのGluβ31に代わって、DDのGluβ97がMg^<2+>を介してDDRαサブユニットと相互作用し、DDRβサブユニットの解離が起こることが示唆された。また、グリセロールデヒドラターゼ(GD)およびGD再活性化因子(GDR)の精製蛋白質も用いて調べたところ、DDRはGDを再活性化できるが、GDRはDDを再活性化できないという再活性化因子の特異性は酵素との複合体形成能によって決定されていることが強く示唆された。これは立体構造に基づく両者の接触面積の計算結果からも支持された。よって、再活性化には安定な酵素一再活性化因子複合体の形成が不可欠であると結論できた。先に、ADP結合型DDRの立体構造を報告したが、再活性化の分子機構解明のためにはATP結合型の構造解析が必要である。今回は、ATP-y-S結合型DDRについて約3Åの分解能で結晶構造解析に成功した。さらに、DD-DDR超分子複合体の構造解析のために、複合体形成の過程で解離するDDRβサブユニットを系外へ除くことにより複合体を安定化し、結晶化を試みたが、結晶は得られなかった。