B12酵素とその分子シャペロン様再活性化因子との超分子複合体の立体構造解析

B12酶与其类分子伴侣再激活剂超分子复合物的三维结构分析

• 批准号: 18054023
• 负责人: 虎谷 哲夫
• 金额: $ 4.1万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18054023/
• 关键词: ラジカル酵素; B12補酵素; ジオールデヒドラターゼ; グリセロールデヒドラターゼ; 再活性化因子; 分子シャペロン; 超分子複合体; 立体構造; メチオニンシンターゼ

我々は不活性化されたB_<12>補酵素関与ジオールデヒドラターゼ(DD)ホロ酵素を再活性化するDD再活性化因子(DDR)を発見し、生化学的および結晶構造学的解析を行って作用機作を明らかにしてきた。本研究では、DDおよびDDRの結晶構造解析の結果からDD-DDR複合体の形成に重要であると予測されるアミノ酸残基に変異を導入した変異型蛋白質の作成と機能解析、ATPアナログ結合型DDRの結晶構造解析、DD-DDR超分子複合体の結晶化、の3点について研究を行った。まず、変異型DDRと野生型DDを共発現した大腸菌の透過性菌体の系を用いて、グリセロールで不活性化されたDDの再活性化を調べた結果とDDおよびDDRの立体構造から、DD-DDR複合体中ではDDRのGluβ31に代わって、DDのGluβ97がMg^<2+>を介してDDRαサブユニットと相互作用し、DDRβサブユニットの解離が起こることが示唆された。また、グリセロールデヒドラターゼ(GD)およびGD再活性化因子(GDR)の精製蛋白質も用いて調べたところ、DDRはGDを再活性化できるが、GDRはDDを再活性化できないという再活性化因子の特異性は酵素との複合体形成能によって決定されていることが強く示唆された。これは立体構造に基づく両者の接触面積の計算結果からも支持された。よって、再活性化には安定な酵素一再活性化因子複合体の形成が不可欠であると結論できた。先に、ADP結合型DDRの立体構造を報告したが、再活性化の分子機構解明のためにはATP結合型の構造解析が必要である。今回は、ATP-y-S結合型DDRについて約3Åの分解能で結晶構造解析に成功した。さらに、DD-DDR超分子複合体の構造解析のために、複合体形成の過程で解離するDDRβサブユニットを系外へ除くことにより複合体を安定化し、結晶化を試みたが、結晶は得られなかった。

I 々 は not activeness さ れ た B_ < 12 > masato and repair enzyme ジ オ ー ル デ ヒ ド ラ タ ー ゼ (DD) ホ を ロ enzyme activeness す again る DD again activation factor (DDR) を 発 see し, biochemistry お よ び crystallization tectonics line analytical を っ て function machine for を Ming ら か に し て き た. This study で は, DD お よ び DDR の crystal structure analytical results の か ら DD - DDR complex の form important で に あ る と be さ れ る ア ミ ノ acid residues に - different を import し た - different protein の と consummate function parsing, ATP ア ナ ロ グ combination type DDR の crystal structure, the DD - DDR supramolecular complexes の crystallization, の 3 PM Youdaoplaceholder0 に った て て study を lines った. ま ず, - DDR と wild-type DD を 発 now total し た coliform の permeability bacteria の is を with い て, グ リ セ ロ ー ル で not activeness さ れ た DD の again activeness を adjustable べ た results と DD お よ び DDR の three-dimensional structure か ら, DD - DDR complex で は DDR の Glu beta 31 に generation わ っ て, DD の Glu beta 97 が M G ^ 2 + < > を interface し て DDR alpha サ ブ ユ ニ ッ ト と し interaction, DDR beta サ ブ ユ ニ ッ ト の dissociation が up こ る こ と が in stopping さ れ た. ま た, グ リ セ ロ ー ル デ ヒ ド ラ タ ー ゼ (GD) お よ び GD again activation factor (GDR) の refined protein も い て adjustable べ た と こ ろ, DDR は GD を again activeness で き る が, GDR は DD を again activeness で き な い と い う の specificity は enzyme activation factor again と の complex formation can に よ っ て decided さ れ て い る こ Youdaoplaceholder0 strongly く incites された. The calculation results of the <s:1> contact area <e:1> of the に basis づく of the <s:1> three-dimensional structure ら れ support された. Youdaoplaceholder0, reactivation に, <s:1> diazepam な enzyme reactivation factor complex よって formation が cannot be lacking であると conclusion で た た. First, に, the <s:1> three-dimensional structure of ADP-bound DDR を report the <s:1> たが たが, then activate the <s:1> molecular structure to clarify the <s:1> ために ために, and the analysis of ATP-bound <s:1> structure が is necessary である. This time, the, ATP-y-S combined DDRに, に て て て て approximately 3A the <s:1> decomposition energy で the crystal structure analysis に was successful た た. さ ら に, DD - DDR supramolecular complexes の structure の た め に, complex formation の で dissociation す る DDR beta サ ブ ユ ニ ッ ト を extrasolar へ except く こ と に よ り complex を stabilization し, crystallization を try み た が, crystallization は ら れ な か っ た.

项目成果

Molecular basis for specificities of reactivating factors for adenosylcobalamin‐dependent diol and glycerol dehydratases

• DOI: 10.1111/j.1742-4658.2007.06074.x
• 发表时间: 2007-11
• 期刊: The FEBS Journal
• 作者: H. Kajiura;K. Mori;N. Shibata;T. Toraya

Survey of catalytic residues and essential roles of glutamate-α170 and aspartate-α335 in coenzyme B12-dependent diol dehydratase

谷氨酸-α170 和天冬氨酸-α335 在辅酶 B12 依赖性二醇脱水酶中的催化残基和重要作用的调查

• 发表时间: 2006
• 期刊: Journal of Biological Chemistry 281(27)
• 作者: H.Matsumura;H.Takahashi;T.Inoue;T.Yamamoto;H.Hashimoto;M.Nishioka;S.Fujiwara;M.Takagi;T.Imanaka;Y.Kai;Sakai T;Kawata M
• 通讯作者: Kawata M

Construction and characterization of hybrid dehydratases between adenosylcobalamin-dependent diol and glycerol dehydratases.

• DOI: 10.3177/jnsv.53.102
• 发表时间: 2007-04
• 期刊: Journal of nutritional science and vitaminology
• 影响因子: 1.6
• 作者: T. Sakai;A. Yamasaki;Satoshi Toyofuku;Tsuneo Nishiki;Michio Yunoki;Noriaki Komoto;T. Tobimatsu;T. Toraya

Histidine-a143 Assists 1,2-Hydroxyl Group Migration and Protects Radical Intermediates in Coenzyme B12-Dependent Diol Dehydratase

组氨酸-a143 协助 1,2-羟基迁移并保护辅酶 B12 依赖性二醇脱水酶中的自由基中间体

• 发表时间: 2008
• 期刊: Biochemistry 47(10)
• 作者: Kinoshita K;Kawata M;Ogura K;Yamasaki A;Watanabe T;Komoto N;Hieda N;Yamanishi M;Tobimatsu T;Toraya T
• 通讯作者: Toraya T

B12補酵素関与ジオールデヒドラターゼその再活性化因子の変異型蛋白質の機能解析

B12辅酶相关二醇脱水酶突变蛋白及其激活剂的功能分析

• 发表时间: 2007
• 作者: M.Kashii;R.Fujisawa;H.Adachi;Y.Mori;T.Sasaki;Y.Koga;K.Takano;S.Kanaya;H.Matsumura;T.Inoue;S.Murakami;K.Sugamoto;H.Yoshikawa;森 光一
• 通讯作者: 森 光一