アデノシルコバラミンの補酵素活性の発現と維持に関わる蛋白質の機能解析

参与腺苷钴胺素的表达和辅酶活性维持的蛋白质的功能分析

• 批准号: 09235221
• 负责人: 虎谷 哲夫
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09235221/
• 关键词: ビタミンB_<12>補酵素; アデノシルコバラミン; ジオールデヒドラターゼ; 再活性化因子; メチオニンシンターゼ; 遺伝子クローン化; Klebsiella oxytoca

1.アデノシルコバラミン関与ジオールデヒドラターゼの高発現、精製および性質先にクローン化したジオールデヒドラターゼのサブユニット遺伝子を様々な組み合わせで大腸菌に高発現させたところ、それぞれのサブユニットは相互に影響を及ぼし合いながら活性な立体構造に折りたたまれることが示された。3つのサブユニットを同時に高発現させた大腸菌からジオールデヒドラターゼを単一にまで精製するための簡便な方法を確立した。組換え体の精製酵素はα_2β_2γ_2のサブユニット構造をとっており、親菌Klebsiella oxytocaから精製した酵素と同様の性質を示した。2.ジオールデヒドラターゼの再活性化因子の遺伝子クローン化と塩基配列解析および大量発現ジオールデヒドラターゼは、生理的基質の一つであるグリセロールにより酵素反応中に自殺不活性化を受ける。K.oxytocaには不活性化されたホロ酵素をアデノシルコバラミン、AT、Mg^<2+>存在下で再活性化する系が存在する。本研究では、3'-隣接領域に存在する2つの遺伝子が再活性化因子の遺伝子であると同定できた。塩基配列の解析より、再活性化因子は、610アミノ酸残基、分子量64,266と、125アミノ酸残基、分子量13,620の2つのサブユニットから成ることが分かった。この2つの遺伝子をそれぞれddrA、ddrB遺伝子と名付けた。ホモロジー検索により、このような再活性化因子はグリセロールデヒドラターゼにも存在することが強く示唆された。3.ラット肝臓コバラミン関与メチオニンシンターゼの精製と性質コバラミン関与メチオニンシンターゼをラット肝臓より精製した。Mono-Qカラムクロマトグラフィーにより酵素は2つの活性画分に分かれた。これらを溶出する順番にピークI、IIとすると、ピークI、IIの酵素はそれぞれ18,000倍、44,000倍に精製された。活性の回収率はそれぞれ0.7%および1.8%であった。これら2つのピークの相互転換は認められなかった。主要な画分であるピークIIの酵素は分子量約143,000の単量体であり、電気泳動的に単一に精製された。活性の発現には還元系とS-アデノシルメチオニンが必要であった。

1. ア デ ノ シ ル コ バ ラ ミ ン masato and ジ オ ー ル デ ヒ ド ラ タ ー ゼ の 発 now, refined お よ び nature first に ク ロ ー ン change し た ジ オ ー ル デ ヒ ド ラ タ ー ゼ の サ ブ ユ ニ ッ ト posthumous son 伝 を others 々 な group み close わ せ で coliform に high 発 now さ せ た と こ ろ, そ れ ぞ れ の サ ブ ユ ニ ッ ト は を and influence each other に ぼ し close い な が な ら activity The three-dimensional structure に fold たたまれる たたまれる とが とが shows された. 3 つ の サ ブ ユ ニ ッ ト を and high に 発 now さ せ た coliform か ら ジ オ ー ル デ ヒ ド ラ タ ー ゼ を 単 a に ま で refined す る た め の simple を な method established し た. Group in え body の refining enzyme は alpha beta _2 _2 gamma _2 の サ ブ ユ ニ ッ ト tectonic を と っ て お り, bacteria Klebsiella oxytoca か ら refined し と た enzyme with others in nature の を shown し た. 2. ジ オ ー ル デ ヒ ド ラ タ ー ゼ の activation factor again の heritage 伝 son ク ロ ー ン change と salt base with column analysis お よ び large 発 now ジ オ ー ル デ ヒ ド ラ タ ー ゼ は, physiological substrate の つ で あ る グ リ セ ロ ー ル に よ り enzyme in reverse 応 に suicide not activeness を be け る. K.o xytoca に は not activeness さ れ た ホ ロ enzyme を ア デ ノ シ ル コ バ ラ ミ ン, ats, Mg ^ 2 + < > で and activeness in the presence of す る department が exist す る. This study で は, 3 '- に 隣 meet field exist す る 2 つ の heritage 伝 child が activation factor の again but 伝 で あ る と with fixed で き た. Salt base with column の parsing よ り, activation factor は again, 610 ア ミ ノ acid residue, molecular weight of 64266 と, 125 ア ミ ノ acid residue, molecular weight of 13620 の 2 つ の サ ブ ユ ニ ッ ト か ら into る こ と が points か っ た. The 伝 son をそれぞれddrA and the 伝 son と of ddrB are named けた. ホ モ ロ ジ ー 検 cable に よ り, こ の よ う な activation factor again は グ リ セ ロ ー ル デ ヒ ド ラ タ ー ゼ に も exist す る こ と が く and shown strong sucking さ れ た. 3. ラ ッ ト routine liver コ バ ラ ミ ン masato and メ チ オ ニ ン シ ン タ ー ゼ の refined と nature コ バ ラ ミ ン masato and メ チ オ ニ ン シ ン タ ー ゼ を ラ ッ ト routine liver よ り refined し た. Mono-Qカラム ロ ロ トグラフィ によ によ によ <s:1> enzyme カラム 2 <s:1> activity score に score れた れた れた. こ れ ら を dissolution す る shun's に ピ ー ク I and II と す る と, ピ ー ク I and II の enzyme は そ れ ぞ れ 18000 times, 44000 times に refined さ れ た. Active <s:1> return rate それぞれ0.7%および1.8%であった. Youdaoplaceholder2 れら2 れら ピ ピ ピ められな った った each 転 is exchanged for ピ to recognize められな められな った った. Main な draw points で あ る ピ ー ク II は の enzyme molecular weight about 143000 の 単 quantity body で あ り, electricity 気 swimming に 単 a に refined さ れ た. The active distribution of に に reducers is とS-アデノシ メチ メチ ニ ニ が が necessary であった.

项目成果

Kazuhiro Yamada: "Purification and Some Properties of Cobalamin-dependent Methionine Synthase from Rat Liver" Journal of Nutritional Science and Vitaminology. 43. 177-186 (1997)

Kazuhiro Yamada：“大鼠肝脏中钴胺素依赖性蛋氨酸合酶的纯化和一些特性”营养科学和维生素学杂志。

M.Yamanishi: "Evidence for Axial Coordination of 5,6-Dimethylbenzimidazole to the Cobalt Atom of Adenosylcobalamin Bound to Diol Dehydratase" Biochemistry. in press. (1998)

M.Yamanishi：“5,6-二甲基苯并咪唑与与二醇脱水酶结合的腺苷钴胺素的钴原子轴向配位的证据”生物化学。

Koichi Mori: "Characterization,Sequencing,and Expression of the Genes Encoding a Reactivating Factor for Glycerol-inactivated Adenosylcobalamin-dependent Diol Dehydratase" Journal of Biological Chemistry. 272 (51). 32034-32041 (1997)

Koichi Mori：“编码甘油失活的腺苷钴胺依赖性二醇脱水酶的重新激活因子的基因的表征、测序和表达”生物化学杂志。

Takamasa Tobimatsu: "Heterologous Expression,Purification and Properties of Diol Dehydratase,an Adenosylcobalamin-Dependent Enzyme of Klebsiella oxytoca" Archives of Biochemistry and Biophysics. 347 (1). 132-140 (1997)

Takamasa Tobimatsu：“二醇脱水酶的异源表达、纯化和特性，一种产酸克雷伯菌的腺苷钴胺依赖性酶”生物化学和生物物理学档案。

Koichi Mori: "A Protein Factor Is Essential for in Situ Reactivation of Glycerol-inactivated Adenosylcobalamin-dependent Diol Dehydratase" Bioscience,Biotechnology and Biochemistry. 61 (10). 1729-1733 (1997)

Koichi Mori：“蛋白质因子对于甘油灭活的腺苷钴胺依赖性二醇脱水酶的原位再激活至关重要”生物科学、生物技术和生物化学。