IP_3誘導Ca^<2+>放出チャネルの構造・機能相関

IP_3诱导的Ca^<2+>释放通道的结构-功能关系

基本信息

批准号：
07276210
负责人：
古市貞一
金额：
$ 1.92万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

IP_3受容体はIP_3によって活性化される細胞内Ca^<2+>放出チャネルで、その構造・機能を解析した。1.タイプ1のIP_3結合領域(アミノ末端側734アミノ酸)を大腸菌で発現させる系を開発した。IP_3は負のリン酸基を3つもつので、この領域内にある正のLysとArgを部位特異的置換することによりリガンド結合アミノ酸を解析した。その結果、Arg-265、Lys-508、Arg-511はIP_3結合に必須であった。また、Arg-568のGlnへの置換はIP_3と1,3,4,5-IP_4の結合親和性を低下させた。2.カルモジュリン結合領域を解析した。タイプ1では、cAMP依存性キナーゼのリン酸化基質となるSer-1588の近傍の配列(Lys-1564からArg-1585)が結合に必須であった。タイプ2の類似した配列(Lys-1565からArg-1587)も結合した。タイプ3ではこの配列が存在せず、カルモジュリンによる制御の違いが示唆された。3.IP_3誘導Ca^<2+>放出(IICR)のキネティクスを精製受容体/人工リポソーム/fluo-3系で解析した。IICRは二相性(速い相(f相)と遅い相(s相))を示し、初速度のEC_<50>は100nM IP_3であった。Hill係数は1.8と正の協同性を示した。f相の見かけの速度定数(k_<fast>=0.3-0.7s^<-1>)はs相(k_<slow>=0.03-0.07s^<-1>)の約10倍であった。f相によるCa^<2+>放出はIP_3濃度に依存して増加(量子的放出)を示したが、s相によるCa^<2+>放出量はほぼ一定であった。これより、IP_3受容体は2つのIP_3結合状態をもち、f相は低親和性、s相は高親和性の状態であることが示唆された。4.カビの代謝産物であるアデノフォスチン(AP)は、拮抗的でより強力なアゴニスト作用をもつ。AP誘導Ca^<2+>放出もIICRとよく似たキネティクスを示したが、高い協同性(Hill係数3.9)があった。〔^3H〕-IP_3結合の拮抗阻害実験では、IP_3に協同性はないが(Hill係数1.1、Ki=41nM)APは正の協同性(Hill係数1.9、Ki=10nM)を示した。

IP_3受体是由IP_3激活的细胞内CA^<2+>，分析其结构和功能。 1。开发了一个系统来表达大肠杆菌中1型IP_3结合区域（氨基末端的734个氨基酸）。由于IP_3具有三个负磷酸基团，因此通过位点特异性替代阳性LYS和该区域内的ARG分析配体结合氨基酸。结果，ARG-265，LYS-508和ARG-511对于IP_3绑定至关重要。此外，用GLN替换ARG-568可降低IP_3和1,3,4,5-IP_4之间的结合亲和力。 2。分析了钙调蛋白结合区域。在类型1中，Ser-1588（Lys-1564至ARG-1585）附近的序列是CAMP依赖性激酶（Lys-1564至ARG-1585）的磷酸化底物，对于结合至关重要。还连接了类似的2型（LYS-1565至ARG-1587）序列。该序列在3型中不存在，这表明钙调蛋白在控制方面存在差异。 3。使用纯化的受体/人工脂质体/Fluo-3系统分析IP_3诱导的Ca^<2+释放（IICR）的动力学。 IICR显示双相（快速（F相）和慢速（S相）），初始速度EC_ <50>为100 nm IP_3。山丘系数为1.8，表现为积极的合作。 F相的表观速率常数（k_ <fast> = 0.3-0.7S^<-1>）大约是S相的10倍（K_ <slow> = 0.03-0.07S^<-1>）。 Ca^<2+>通过F期释放，根据IP_3浓度显示出增加（量子释放），但是S期通过S期释放的量几乎是恒定的。这表明IP_3受体具有两个IP_3结合态，而F相具有低亲和力，而S相具有高亲和力。 4。腺植物（AP）是一种真菌的代谢产物，具有拮抗和更有效的激动剂作用。 AP诱导的Ca^<2+>释放也表现出与IICR相似的动力学，但具有很高的合作性（Hill系数3.9）。在[^3H] -IP_3结合拮抗抑制实验中，尽管IP_3没有合作性（Hill系数1.1，Ki = 41nm），但AP显示出正相的合作性（山系数1.9，Ki = 10nm）。