多糖化による卵白リゾチームの安定化と不安定変異体の高発現

通过多糖化稳定蛋清溶菌酶和不稳定突变体的高表达

基本信息

批准号：
07280219
负责人：
加藤昭夫
金额：
$ 1.6万
依托单位：
Yamaguchi University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究者はタンパク質を安定化する戦略として、タンパク質を多糖化することが有効であると考え研究を行い、卵白リゾチームを酵母発現系で多糖化すると熱安定型リゾチームが得られることを報告している。リゾチームの分子表面β-ターン領域の部位指定変異によりN-グリコシル型糖鎖結合認識配列Asn-X-Thr(Ser)を作成し、酵母中で発現させると元の立体構造や活性を保持した状態で、約300個のマンノース残基が結合したhigh mannose型の多糖鎖が結合した多糖化リゾチームが高含量で分泌した。この多糖化リゾチームはpH2.5から9.0までの広いpH領域下で100℃に加熱しても不溶化せず安定であり、その構造安定性の熱力学的解析をするのに都合の良い研究試料である。今回はリゾチームの19位および49位のAsnにN-結合型ポリマンノシル基が結合した多糖化リゾチームを用いて、DSCによる熱測定などにより、熱安定化機構の解明を行った。その結果、多糖化により変性分子の凝集が抑えられ、変性の可逆性が著しく増加することが明らかになった。しかしながら、多糖化によりリゾチームの変性転移点(Tm)は低下し、また変性のエンタルピー変化、エントロピー変化も低下した。これらの結果から、蛋白質は多糖化により、その立体構造の安定化は得られないが、変性状態の挙動が異なり、リフォールディングが容易になり、見かけの安定性が高まるものと考えられる。

研究人员认为，蛋白质的多糖化是稳定蛋白质的策略，并进行了研究，并报告说，酵母表达系统中蛋清白溶菌酶的多糖化可以产生热稳定的溶菌酶。在溶菌酶的β-扭转区域，N-糖基类型的聚糖结合识别序列ASN-X-THR（SER）的位点指定突变，当在酵母中表达多疗中含糖液溶酶体在酵母中表达，并在Yeast中含有较高的lysozyme andsnosanceme lysozyme的高含量液体含量，以较高的含糖液含量为单位。残留物附着，同时保留其原始的三维结构和活性。即使加热至100°C时，这种多含糖的溶菌酶也不稳定，而无需溶解。这次是多含糖溶菌酶，其中使用N-连接的聚甘露糖基团与ASN结合在溶菌酶的第19和49位，用于阐明通过使用DSC进行热测量的热稳定的机制。结果，polysacciention揭示了polysacification抑制了polysacefiencation抑制了依然的依赖性，并有效地提高了分类的分析，并且有效地提高了分物的依赖性。然而，多糖化降低了溶菌酶的变性过渡点（TM），并减少了变性的焓和熵变化。这些结果表明，尽管蛋白质的3D结构不能通过多糖化稳定，但变性状态是不同的，重新折叠的促进，并且显然稳定性增加。