多糖化による卵白リゾチームの安定化と不安定変異体の高発現

通过多糖化稳定蛋清溶菌酶和不稳定突变体的高表达

• 批准号: 08272222
• 负责人: 加藤 昭夫
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Yamaguchi University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08272222/
• 关键词: グリコシル化リゾチーム; カルネキシン; 酵母発現系

本研究者は多糖化リゾチームを酵母発現系で分泌させると、見かけの構造の安定性が増加すること、プロテアーゼに耐性を示すことを明らかにした。これらの結果は、多糖化により、微量かあるいは全く分泌しない不安定変異リゾチームを高分泌できることを示しており、今年度はこの手法を用いることにより、不安定なSS結合除去変異体(C76/94A)、α^-ヘリックス双極子不安定化変異体(K13D)、分子内疎水性パッキング低減化変異体(I55V)を分泌させ、その後多糖鎖を除去することにより、通常の手段では発現できない変異体の折れたたみ機構を研究した。その結果、次のような知見が得られた。(1)少量しか分泌しない変異体リゾチームcDNAを部位指定変異により活性中心から離れた分子表面(49位および19位)にN型糖鎖認識配列Asn-X-Thrを導入するように改変し、これを酵母発現ベクターに組込み、形質転換した酵母を用いて大量に培養し、培養液に分泌した多糖化リゾチームをカチオン交換樹脂(CM-トヨパール)に吸着させ、溶出させた。こうして得られた種々の不安定変異体(SS結合除去変異体、ヘリックス不安定化変異体、分子内疎水性パッキング低減化変異体)は多糖化しても、高分泌しなかった。(2)この結果は糖蛋白質に特異的な分子シャペロンカルネキシンによる品質管理によるものと推測し、カルネキシンを欠損させた変異株を用いて、分泌を試みたところ高発現、分泌させることができた。

研究人员透露，酵母表达系统中多糖溶菌酶的分泌增加了表观结构的稳定性，并且对蛋白酶具有抗性。 These results show that polysaccharification allows for high secretion of unstable mutant lysozyme, which does not secrete trace or at all, and this year, this method was used to secrete unstable SS-binding removal mutants (C76/94A), α^-helix dipole destabilizing mutants (K13D), and intramolecular hydrophobic packing reduction mutants (I55V), followed by去除多糖链，以研究无法通过正常方式表达的突变体的折叠机理。结果，获得了以下发现：（1）对仅分泌少量的突变溶菌酶cDNA进行了修改，以引入分子表面的N型聚糖识别序列ASN-X-THR（位置49和19）（位置49和19）（位置49和19分泌到培养基中的多糖溶菌酶被吸附在阳离子交换树脂（CM-Toyopearl）上并洗脱。因此获得的各种不稳定的突变体（SS结合去除突变体，螺旋不稳定突变体和分子内疏水堆积还原突变体）在多糖化后不会更高度分泌。 （2）我们推测该结果是由于使用糖蛋白特异性分子伴侣钙蛋白钙粘蛋白的质量控制造成的，并且使用缺乏钙网蛋白的突变菌株尝试了分泌，从而导致高表达和分泌。