多糖化による卵白リゾチームの安定化と不安定変異体の高発現

通过多糖化稳定蛋清溶菌酶和不稳定突变体的高表达

基本信息

批准号：
09261226
负责人：
加藤昭夫
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Yamaguchi University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09261226/
关键词：
多糖修飾リゾチームシャペロンカルネキシン

项目摘要

酵母発現系を用いて、N-型糖鎖認識シグナルを導入することにより、リゾチームの変異体を発現させると、付加糖鎖によるシャペロン様の機能により変異体は細胞内で保護され、高分泌することを明らかにしてきた。^<1),2)>この高分泌型はG49N,R21T,E35A,S91Tなどの安定型変異体リゾチームに認められたが、一方、SS結合除去変異体(C76/94A)、α-ヘリックス双極子不安定化変異体(K13D,K33D,K97D)、分子内疎水性パッキング低減化変異体(I55V)の場合は、糖鎖付加の影響はあまり認められず、むしろ分泌量が抑制される傾向が認められた。この相違は酵母小胞体での糖蛋白に特異的なシャペロン(カルネキシン)による品質管理が予想され、これを回避するために、我々はカルネキシンをノックアウトした酵母を作成し,このカルネキシン欠損酵母を用いて、不安定変異体を高分泌させることを目的とした。その結果カルネキシン欠損酵母ではグリコシル化した不安定変異リゾチーム(K13D,C76A,I55V)は高分泌し、野生型酵母ではこれらの変異体はほとんど分泌されなかった。この結果は糖蛋白に特異的な分子シャペロンであるカルネキシンが不安定変異体をトラップし、分泌を抑制するいわゆる品質管理機能を示すことを証明したものである。と同時に、づあんてい変異体の高分泌を可能にする手段を示したものである。また、安定な変異体(G49N,R21T,S91T)はグリコシル化により、多量に分泌し、野生型酵母でもカルネキシン欠損酵母でも分泌量に変化はなく、安定な変異体は品質管理を受けないことが示された。

已经表明，当使用酵母表达系统引入N型聚糖识别信号来表达溶菌酶突变体时，由于添加的糖链的伴侣样函数，该突变体受到细胞的保护并高度分泌。 ^<1），2）>在稳定的突变体中观察到这种高度分泌的形式，例如G49N，R21T，E35A和S91T，但在SS结合去除突变体（C76/94A）的情况下，α-螺旋二翼型二哌取代突变体（K13D，K33D，INTROPH，K33D，K977D），和k33d，K977D），和k33d，k977d），和k33d，k33d，k977d）（i55v），糖基化的作用很小，实际上，抑制分泌的趋势。预计这种差异将通过酵母内质网中糖蛋白具有特异性的伴侣蛋白（钙粘蛋白）提供质量控制，并为避免这种情况，我们创造了一种酵母，使酵母敲除钙钙蛋白粉红细胞蛋白，并使用这种钙钙缺乏的酵母来促进不稳定突变体的高分泌物。结果，糖基化的不稳定的突变溶菌酶（K13D，C76A，I55V）在缺乏钙蛋白钙蛋白酶的酵母中高度分泌，并且这些突变中很少有野生型酵母分泌。该结果表明，钙粘蛋白是一种针对糖蛋白的分子伴侣，表现出所谓的质量控制功能，可捕获不稳定的突变体并抑制分泌。同时，它显示了一种允许对Zuantei突变体进行高分泌的手段。此外，稳定的突变体（G49N，R21T，S91T）通过糖基化分泌大量，并且在野生型酵母和缺乏钙钙蛋白的酵母中，分泌量没有变化，表明稳定的突变体不会稳定的质量控制。