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多糖化による卵白リゾチームの安定化と不安定変異体の高発現

通过多糖化稳定蛋清溶菌酶和不稳定突变体的高表达

基本信息

批准号：
09261226
负责人：
加藤昭夫
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Yamaguchi University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09261226/
关键词：
多糖修飾リゾチームシャペロンカルネキシン

项目摘要

酵母発現系を用いて、N-型糖鎖認識シグナルを導入することにより、リゾチームの変異体を発現させると、付加糖鎖によるシャペロン様の機能により変異体は細胞内で保護され、高分泌することを明らかにしてきた。^<1),2)>この高分泌型はG49N,R21T,E35A,S91Tなどの安定型変異体リゾチームに認められたが、一方、SS結合除去変異体(C76/94A)、α-ヘリックス双極子不安定化変異体(K13D,K33D,K97D)、分子内疎水性パッキング低減化変異体(I55V)の場合は、糖鎖付加の影響はあまり認められず、むしろ分泌量が抑制される傾向が認められた。この相違は酵母小胞体での糖蛋白に特異的なシャペロン(カルネキシン)による品質管理が予想され、これを回避するために、我々はカルネキシンをノックアウトした酵母を作成し,このカルネキシン欠損酵母を用いて、不安定変異体を高分泌させることを目的とした。その結果カルネキシン欠損酵母ではグリコシル化した不安定変異リゾチーム(K13D,C76A,I55V)は高分泌し、野生型酵母ではこれらの変異体はほとんど分泌されなかった。この結果は糖蛋白に特異的な分子シャペロンであるカルネキシンが不安定変異体をトラップし、分泌を抑制するいわゆる品質管理機能を示すことを証明したものである。と同時に、づあんてい変異体の高分泌を可能にする手段を示したものである。また、安定な変異体(G49N,R21T,S91T)はグリコシル化により、多量に分泌し、野生型酵母でもカルネキシン欠損酵母でも分泌量に変化はなく、安定な変異体は品質管理を受けないことが示された。

With the use of the yeast discovery system and the introduction of the N-type sugar lock recognition molecule, variants of the ribosome are discovered, and the function of the sugar lock is protected and highly secreted within the cell.^ <1),2)> High Secretion Type G49N, R21T, E35A, S91T> Stable Type Variants <1),<2),<3),<4),<5),<6),<7),<8),<9),<10),<11),<10)(K13D, K33D, K97D), intramolecular water-soluble compounds (I55V), and the effect of sugar lock addition on the secretion of protein were studied. The quality control of yeast cells is considered to be the most important factor in the production of yeast cells, and the production of yeast cells is not stable. As a result, the mutant yeasts (K13D, C76A, I55V) are highly secreted, while the wild-type yeasts are highly secreted. The result is a demonstration of the ability of glycoprotein-specific molecules to function as inhibitors of instability. The method of high secretion The mutant (G49N, R21T, S91T) is resistant to high levels of protein secretion, and the wild type yeast is resistant to low levels of protein secretion.