ランダム変異を用いたリゾチームのフォルディング情報の解析

使用随机突变分析溶菌酶折叠信息

• 批准号: 08272225
• 负责人: 井本 泰治
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08272225/
• 关键词: リゾチーム; フォルディング; ランダムライブラリー

本研究は、ランダム変異リゾチームをスクリーニングし、蛋白質のフォルディングに関与している残基のマッピングを行うことで、高次構造又は2次構造のどの辺はどのような変換が可能か又は不可能かについての情報を蓄積することを目的としている。そのため、酵母から分泌できないリゾチームをランダムライブラリーからスクリーニングした。すなわち、既に確立しているストレプトマイシン依存性大腸菌を用いたクローニング方法と、活性及びELISAによるスクリーニング系により、活性及び分泌量の減少したものを選び出した。DNAシークエンスの結果、2変異体Asp18His/Leu25ArgおよびAla42Val/ser50Ile/leu56Glnが得られた。これらの変異体を既に開発済みの大腸菌の発現系で生産・単離し、尿素及びグリセロール存在下でin vitroでの巻き戻しを行い、陽イオン交換HPLCにより解析した結果、両変異体ともその変異が原因で不安定となったため酵母から分泌しなかったと考えられた。さらに、これらの変異体のそれぞれの1アミノ酸変異体を作製し同様な解析を行った。この結果、Leu25ArgとLeu56Glnがその不安定さに寄与していて、それ以外の変異は野生型と同様な傾向を示した。このように、多重変異体が得られた場合、それぞれの1アミノ酸変異体を作製し解析することは必要であると思われる。以後、さらにスクリーニングを続けていく予定である。

は, this study ラ ン ダ ム - different リ ゾ チ ー ム を ス ク リ ー ニ ン グ し, protein の フ ォ ル デ ィ ン グ に masato and し て い る residues の マ ッ ピ ン グ を line う こ と で, high structure and は twice の ど の 辺 は ど の よ う な variations in が might か は impossible か に つ い て の intelligence を accumulation す る こ と を purpose と し て い る. そ の た め, yeast か ら secretion で き な い リ ゾ チ ー ム を ラ ン ダ ム ラ イ ブ ラ リ ー か ら ス ク リ ー ニ ン グ し た. す な わ ち, establishment of both に し て い る ス ト レ プ ト マ イ シ ン dependency coliform を with い た ク ロ ー ニ ン グ と, activity and び ELISA に よ る ス ク リ ー ニ ン グ department に よ り, activity and び secretion の reduce し た も の を び from し た. DNA シ ー ク エ ン ス の results 1, 2 - Asp18His/Leu25Arg お よ び Ala42Val ser50Ile/leu56Gln が must ら れ た. The を れら <s:1> variant を is に developed by み <s:1> escherichia coli, which is で produced by 単 in the presence of <s:1>, urea and びグリセロ れら びグリセロ で Vitro で の 巻 き 戻 し を い, Yang イ オ ン exchange HPLC に よ り parsing し た results, struck - variant と も そ の - different が reason で unrest と な っ た た め yeast か ら secretion し な か っ た と exam え ら れ た. さ ら に, こ れ ら の - variant の そ れ ぞ れ の 1 ア ミ ノ acid - variant を cropping し with others in line analytical を な っ た. こ の results, Leu25Arg と Leu56Gln が そ の unrest さ に send し て い て, そ れ outside の - different は wild-type と with others な tendency を shown し た. こ の よ う に, multiple - foreign が ら れ た occasions, そ れ ぞ れ の 1 ア ミ ノ acid - variant を cropping し parsing す る こ と は necessary で あ る と think わ れ る. In the future, さらにス, リ, リ, ニ, グを続けて, く will be determined as である.

项目成果

Maeda,Y.,et al.: "Effect of additives on the renaturation of reduced lysozyme in the presence of 4M urea" Protein Engng.9. 461-465 (1996)

Maeda,Y.,et al.：“添加剂对 4M 尿素存在下还原溶菌酶复性的影响”Protein Engng.9。

Ueda,T.,et al.: "Stabilization of lysozyme by introducing N-glycosylation signal sequence" J.Biochem.119. 157-161 (1996)

Ueda,T.,et al.：“通过引入 N-糖基化信号序列稳定溶菌酶”J.Biochem.119。

Ueda,T.,et al.: "Identification of the peptide region that folds in the early stage of the renaturation of reduced lysozyme" Biohem.Biophys.Res.Commun.(in press). (1996)

Ueda,T.,et al.：“还原溶菌酶复性早期折叠的肽区域的鉴定”Biohem.Biophys.Res.Commun.（出版中）。

Maeda,Y.,et al.: "Effective renaturation of denatured and reduced immunoglobulin G in vitro without assistant of chaperone" Protein Engng.9. 95-100 (1996)

Maeda,Y.,et al.：“在没有分子伴侣辅助的情况下，在体外有效复性变性和还原的免疫球蛋白 G”Protein Engng.9。