ペルオキシダーゼの反応過程における構造変化の結晶学的追跡

ペルオキシダーゼは生体内で生じた過酸化水素を除去するだけでなく、反応過程で生じる活性種を用いて様々な生体物質の代謝に関与している。この酵素は過酸化水素を用いて、ヨウ素イオンなどの無機化合物だけでなくフェノール類などの有機化合物の酸化をも触媒する。この酵素反応は、過酸化水素が分解され酵素自身がcompoundIとよばれる分子種になる過程と、compoundIが還元剤により元の酵素に戻る過程からなる。本研究では真菌Arthromyces ramosusが分泌するペルオキシダーゼ(ARP)をとりあげ、一酸化炭素やヨウ素イオンがARPにどのように結合し、また酵素の構造が変化するかを調べた。1.一酸化炭素の結合様式 アンモニアがヘム鉄に結合しないよう、沈殿剤を硫安から硫酸ナトリウム(50mM Tris HCI,pH7.5)に置換した。これにジチオナイトを加え、さらに窒素ガス、続いてCOガスを吹き込んだ溶液に、ARP結晶を一晩soakした。この結晶の回析強度をCukα線を用いて2.06Å分解能まで測定した。(2F_o-F_c)map上に、COと考えられる電子密度がヘム鉄の第6配位子座に表れた。本解析からCOのヘム面に対する配向は決まらなかった。なお蛋白部分の構造はほとんど変化しなかった。2.ヨウ素イオンの結合部位 ARP結晶を30mMKIを含む緩衝液(pH5.5)にsoakし、ヨウ素イオン結合型を調製した。この結晶の2.06Å4分解能の回析強度を測定し、D合成およびバイフット差フーリエ合成から、I^-の結合部位を決定した(I^-占有率は約30%)。I^-はヘムの遠位側へ通じるチャネルの入口上部に結合していた。I^-はARP表面の小さなくぼみにあり、特定の残基・原子と強い結合はないようである。I^-が接しているIle153の側鎖の内側には活性残基のHis56があり、I^-とヘム鉄との距離は12.8Åである。

ペルオキシダーゼは生体内で生じた過酸化水素を除去するだけでなく、反応過程で生じる活性種を用いて様々な生体物質の代謝に関与している。この酵素は過酸化水素を用いて、ヨウ素イオンなどの無機化合物だけでなくフェノール類などの有機化合物の酸化をも触媒する。この酵素反応は、過酸化水素が分解され酵素自身がcompoundIとよばれる分子種になる過程と、compoundIが還元剤により元の酵素に戻る過程からなる。本研究では真菌Arthromyces ramosusが分泌するペルオキシダーゼ(ARP)をとりあげ、一酸化炭素やヨウ素イオンがARPにどのように結合し、また酵素の構造が変化するかを調べた。1.一酸化炭素の結合様式 アンモニアがヘム鉄に結合しないよう、沈殿剤を硫安から硫酸ナトリウム(50mM Tris HCI,pH7.5)に置換した。これにジチオナイトを加え、さらに窒素ガス、続いてCOガスを吹き込んだ溶液に、ARP結晶を一晩soakした。この結晶の回析強度をCukα線を用いて2.06Å分解能まで測定した。(2F_o-F_c)map上に、COと考えられる電子密度がヘム鉄の第6配位子座に表れた。本解析からCOのヘム面に対する配向は決まらなかった。なお蛋白部分の構造はほとんど変化しなかった。2.ヨウ素イオンの結合部位 ARP結晶を30mMKIを含む緩衝液(pH5.5)にsoakし、ヨウ素イオン結合型を調製した。この結晶の2.06Å4分解能の回析強度を測定し、D合成およびバイフット差フーリエ合成から、I^-の結合部位を決定した(I^-占有率は約30%)。I^-はヘムの遠位側へ通じるチャネルの入口上部に結合していた。I^-はARP表面の小さなくぼみにあり、特定の残基・原子と強い結合はないようである。I^-が接しているIle153の側鎖の内側には活性残基のHis56があり、I^-とヘム鉄との距離は12.8Åである。