ペルオキシダーゼの立体構造に基づく基質の酸化と活性化機構の解明

基于过氧化物酶三维结构阐明底物氧化活化机制

• 批准号: 10129219
• 负责人: 福山 恵一
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10129219/
• 关键词: ペルオキシダーゼ; X線結晶解析; 蛋白質の立体構造

ペルオキシダーゼは生体内で生じた過酸化水素を除去するだけでなく、反応過程で生じる活性種を用いて様々な生体物質の代謝に関与している。この酵素は過酸化水素により酸化を受けcompound Iとよばれる分子種になるが、これはハロゲンイオンなどの無機化合物だけでなくフェノール類などの有機化合物の酸化を触媒する。本研究では真菌Arthromyces ramosusが分泌するベルオキシダーゼ(ARP)をとりあげ、salicylhydroxamic acid(SHA)をはじめとする芳香族化合物やヒドロキシルアミンがARPにどのように結合し、反応にかかわるかを調べた。ARP結晶を25mMのSHAを含む溶液(pH5.5)にsoakし、そのX線回折強度を1.9Å分解能まで測定した。差フーリエ合成から、SHAはARPのヘムの遠位側のチャネル内に深く入り込み、ヘム面とほぼ平行に結合していることが明らかになった。BHAの場合と同じく、SHAのOH、NHおよびC=Oは、それぞれHis56 Nε、Pr0154 O、および,Arg52 Nεと水素結合していた。興味深いことに、native状態の水分子の位置と、SHAの3つの官能基それぞれの位置がほぼ重なる。SHAはBHAに比べOH基を1つ多く持っているが、このOH基はARPと結合していなかった。SHAのOHとヘム鉄原子との距離は4.3Åであり直接的接触はない。NMRとMDから、クレゾール、レゾルシノールやヒドロキノンはARPと多様な結合様式をとっていることが示唆された。示差ベクトルからヒドロキシルアミン(HA)とARPのKdは12.7mMであり、HAが結合することによりヘム鉄は6配位構造に変化した。ARP-HA複合体結晶を調製し、その2Å分解能X線解析の結果、HAはヘムの遠位側のポケットに結合していた。本分解能ではHAの方向を決定することは困難であるが、現在のモデルではHAの窒素原子が鉄に配位し、OH基が遠位ヒスチジン(His56)のNεと水素結合していると考えている。このモデルは共鳴ラマンスペクトルからも支持されている。HAが結合することによるARPの構造変化は無かった。さらにHAとARPとの結合のpH依存性を調べたところ、pKが5.4にあった。この値はHAのpKとよく似ており、HAはの結合のpH依存性はHAの解離による可能性が高いが、His56の解離による可能性も残されている。

In the process of production, the active species are used for the metabolism of biological substances. The enzyme acts as a catalyst for the acidification of organic compounds, especially inorganic compounds. In this study, we investigated the regulation of aromatic compounds secreted by fungi Arthromyces ramosus (ARP) and salicylhydroxyl acid(SHA). ARP crystallisation in SHA 25mM solution (pH 5.5) soaks and its X-ray reflection intensity is measured at 1.9 ° C. The difference between the two sides is that the distance between the two sides of the plane is not long. BHA's field is the same as SHA's OH, NH's C=O's, His56 Nε, Pr0154 O's,Arg52 Nε and water's combination. The position of the water molecule in the state of interest, the position of the functional group in the state of native, and the position of the functional group in the state of native are all important. SHA BHA is more than OH group 1, and OH group 1 is more than ARP group 1. SHA OH NMR is a combination of IR, IR The Kd of the differential beta-cyclodextrin (HA) and ARP is 12.7 mM, and since HA binds, the iron has a 6-coordinate structure. ARP-HA complex crystal modulation, two decomposition energy X-ray analysis results, HA on the distal side of the complex binding The decomposition energy is determined by the orientation of HA, which is difficult to determine. The present decomposition energy is determined by the iron coordination of HA's element atoms, the remote-site coordination of OH groups, and the binding of Nε to water elements. This is the first time that I've ever heard of it. HA is a combination of ARP and structure. The pH dependence of HA and ARP was adjusted to 5.4. The pH dependence of HA on pK and HA on dissociation is high and the probability of His56 dissociation is high.

项目成果

Kikuo Tsukamoto: "Binding of Salicyl hydrcxamicacid and Several Aromatic Donor Molecules to Arthromyces ramosus Poroxidase Investigated by X-ray Crystallography, Optical Difference Spectroscopy, NMR Relaxation Molecular Dynamics, and Kinetics" Biochemistr

Kikuo Tsukamoto：“通过 X 射线晶体学、光学差光谱、NMR 弛豫分子动力学和动力学研究水杨基羟肟酸和几种芳香族供体分子与支枝节霉菌过氧化物酶的结合”