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C型肝炎ウィルスの増殖により発現制御されるがん化要因遺伝子の探索

寻找其表达受丙型肝炎病毒增殖调节的致癌基因

基本信息

批准号：
08264244
负责人：
加藤宣之
金额：
$ 2.88万
依托单位：
National Cancer Center Research Institute and Research Center for Innovative Oncology, National Cancer Center Hospital East
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08264244/
关键词：
C型肝炎ウィルス HCV増殖系 HCV感染細胞 HCV分子種マイナス鎖RNA Diffeerential display

项目摘要

本研究ではC型肝炎ウイルスの感染により細胞がどのような変化を受け、がん化の方向に誘導されるかを調べることを目的として培養細胞を用いたHCVの持続感染系の開発を行ない、感染細胞内におけるHCVの量的及び質的解析を行なった。同時に、HCV感染により細胞が受ける影響についても解析した。(1)培養細胞を用いたHCV増殖系のCharacterization PCR法を用いたHCV RNAの半定量的解析を開発し、HCVに感受性を示すヒトリンパ球由来のMT-2C細胞内においてHCV RNAが経時的に増加することを明らかにした。また、細胞内におけるHCVの複製中間体と考えられるマイナス鎖RNAを鎖特異的方法を用いて検出することができた。(2)ヒト肝細胞由来の細胞株を用いたHCV増殖系の開発ヒト肝の非がん部由来でSV40ラージT抗原の導入により不死化したPH5CH細胞を用いたHCVの増殖系の開発に成功した。さらに細胞をクローン化することによりHCVの複製効率の良い3種類の細胞株を得た。(3)HCVの長期培養システムの確立感染後の培養温度を37°Cから32°Cに低下させることによりHCVを長期間培養維持できることを見い出した。32°Cでの培養では最大6.5カ月HCVを維持でき、HCVのcell-freetransmissionの効率も37°Cに較べて良いことが分かった。HCVの複製増殖を制御する因子として増殖因子やサイトカインを想定して各種因子の量を測定したところ、TNF-αのみが32°Cで著しく低下していることが分かった。(4)HCV感染細胞におけるHCV分子種の解析 HCV感染後12日目の細胞におけるHCV分子種を調べた結果、感染に使われた血清中に認められた多くのHCV分子種のうち、ある限られた分子種に収束していることが判明した。従って、細胞に対するHCVのadaptationが示唆された。(5)HCV増殖により発現異常を示す細胞遺伝子の探索HCV感染後1週間以上経過したMT-2C細胞、PH5CH細胞及び未感染細胞由来の総RNAを用いて、RT-PCRをベースにしたdifferential displayを行なった。その結果、HCV感染細胞由来のRNAにのみ検出されるPCR産物がいくつか得られ、現在、それらについて解析中である。

The aim of this study was to investigate the development and quantitative and qualitative analysis of HCV in HCV infected cells using cultured cells. At the same time, HCV infection affects the cells and causes them to resolve. (1)Characterization PCR of HCV clone in cultured cells was used to develop a semi-quantitative analysis of HCV RNA, and HCV susceptibility was demonstrated to increase HCV RNA production in MT-2C cells. HCV replication intermediates in cells are identified by specific methods. (2)The development of HCV propagation line in PH5CH cells was successfully carried out by introducing SV40-T antigen into the liver. Three cell lines with excellent HCV replication rates were obtained. (3)HCV long-term culture system and establishment of infection after the culture temperature from 37°C to 32°C to reduce the temperature of HCV long-term culture maintenance. HCV maintenance at 32°C and efficiency of HCV cell-freetransmission at 37°C are better than those at 32 ° C. HCV replication control factors and growth factors are expected to determine the amount of various factors, such as TNF-α and TNF-α, at 32°C. (4) Analysis of HCV molecular species in HCV infected cells 12 days after HCV infection. The adaptation of HCV in cells and cells is not easy to detect. (5) Detection of HCV infection by differential display of cellular DNA, RT-PCR and RNA from MT-2C cells, PH5CH cells and uninfected cells more than 1 week after HCV infection. Results, HCV infection cell origin RNA detection, PCR product analysis, present, analysis