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細胞分裂・分化過程における細胞内蛋白分解酵素の活性化と生理機能の分子遺伝学的解析

细胞分裂和分化过程中细胞内蛋白酶的激活和生理功能的分子遗传学分析

基本信息

批准号：
08278205
负责人：
榎森康文
金额：
$ 1.6万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

細胞分裂および発生・分化過程において、タンパク分解は重要な位置を占めるが、分解酵素-基質-調節機構の3者が明確に解析されている例は少ない。本研究は、広く動物界に普遍的に存在する細胞内中性プロテアーゼであるカルパインを対象に、ショウジョウバエを実験系として選び、その基質を明確に捉えながら解析することで、細胞分裂・分化過程における機能を明らかにすることを目的として、以下の解析を行った。(1)Notch、quail、singed、および、chickadeeのcDNAをRT-PCR法で得、これを大腸菌内でGST融合タンパク質として発現させ、これをグルタチオン・セファロースカラムによって精製した標品を得た。(2)既に得ているカルパイン抗体と基質タンパク質抗体を用いて、細胞免疫化学的に細胞内局在性を多重染色法によって観察した。さらに、アクチン繊維との関連を詳細に明らかにし、細胞骨格系およびNotch受容体とカルパインの組織学的関連を明らかにした。(3)ショウジョウバエのカルパインcDNAを新規の発現方法を確立することによって、活性ある形で大腸菌に発現させることに成功し、これを精製した。こうして得たショウジョウバエ・カルパインを基質と反応させて、切断活性を検討し、一部に関しては、マイクロシーケンシング法によって切断部位を決定した。これらの実験から、カルパインは、特定のアクチン結合タンパク質を特異的に、かつ、限定的に切断し、その結果、特徴ある活性を有するタンパク質機能断片を生成させることが明らかになった。

Cell division, development and differentiation process, decomposition, important position, decomposition enzyme-matrix-regulatory mechanism, three clear analysis, example This study aims to clarify the role of neutral cells in the process of cell division and differentiation, and to analyze the following aspects of cell division and differentiation. (1) cDNA of Notch, quail, singed, chicken and chickadee were obtained by RT-PCR, GST fusion protein was developed in E. coli, and standard products were purified. (2)The results showed that there was no significant difference between the two groups, and the results showed that there was no difference between the two groups. The relationship between cytoskeleton and Notch receptor is described in detail. (3)A new method for the production of Escherichia coli cDNA was established. In this case, the substrate and the active part of the substrate are determined by the reaction method. This is the first time that a person has ever been involved in an activity that is specific to the nature of the activity.